流式细胞术的临床应用

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1、流式细胞术在临床上的应用深圳市人民医院临床医学研究中心李富荣第一部分流式细胞仪（FCM)）工作原理FCM系统结构流体系统：样本流、鞘液光学系统：激光光源、分光镜、滤片、散射光和荧光探测器分选系统：压电晶体、液流成滴、加电系统、偏转系统数据处理系统：计算机工作站FCM工作原理流程：样本（血液实体组织）单细胞悬液荧光染料特异染色的样本上机细胞单列通过测量区1.散射光信号2.荧光信号分离、收集、分析、光信号细胞理化特性分析图加入荧光染料激光激发流式细胞仪的构造及原理FCM测量光信号获取与分析散射光信号●前向散射光(FSC)----细胞大小●侧向散射

2、光（SSC)---细胞粒度（膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量）FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。根据FSC-SSC二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)与Mono(R2)R1R2IncidentLightSourceRightAngleLightDectectoraCellComplexityForwardLightDetectoraCellSurfaceAreaR3R2R1根据FSC-SSC二维点图，可以容易的区分出Lym(R3).Gran(R1)与Mono(R2)

3、流式细胞术常用染料及检测波长荧光染料的发射不同波长DNA和RNA荧光探针的理化特性荧光探针分子量结合方式碱基特异性激发锋（nm)发射锋(nm)P1668嵌入无493630EB394嵌入无482616MI1069非嵌入G-C320,445575CA31183非嵌入GC320,445575HO33258624非嵌入AT343480HO33342615非嵌入AT343455DAPI350非嵌入AT5406507-AAD1270嵌入GC540655AO370嵌入(双链）无492530静电（单链）640PY303嵌入(双链）GC>AT549-56256

4、5-574静电（单链）细胞周期分析通过荧光探针对细胞周期进行相对DNA含量的测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNA异倍体G1SG2GoM分选系统（Sorting)依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：●电荷式分选稳定液流测量区液滴形成液滴充电液滴偏转分选收集逻辑电路电荷式分选通道式分选稳定液流测量区逻辑电路捕获管分选收集第二部分流式细胞术在临床医学中的应用流式临床应用淋巴细胞亚群分析Th1/Th2肿瘤学HLA-B27PNH四聚体血小板活化细胞凋亡移植免疫常用淋巴细胞亚群报告模式R深圳市人民医院流式细胞术报告单模式H

5、LA-B27通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性。Th1/Th2细胞肿瘤学细胞凋亡移植免疫四聚体Tetramer-原理内源性抗原外源性抗原Tetramer-原理MHCClassI-HLA-A2Tetramer-原理Tetramer-原理国外医学免疫学分册2001；24(2):102-105HLAClassI限定性肿瘤抗原肽抗原特异性CTL的分析方法51Cr释放实验PCR法酶联免疫斑点法(ELISPOT)扩增特异T淋巴细胞受体T

6、etramer法间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低，费时费力难以广泛应用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀释法(LDA)用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5%的CD8+细胞对CMV和EBV特异Tetramer法DohertyPC.Thenumbersgameforvirus-specificCD8+Tcells[J].Science,1998,280:227了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命检测病毒特异性CD8细胞

7、的金标准(GoldStandard)Tetramer-应用感染性疾病HIV-AIDS,EBV,CMV,HPV,HBV,HCV,Influenza,Measles,Malaria,TBandRSVBreast,Prostate,Melanoma,Colon,Lung,Cervical,OvarianandLeukemiaDiabetes,Lymedisease,Multiplesclerosis,Rheumatoidarthritis,AutoimmunevitiligoEBVandCMV移植自身免疫性疾病肿瘤感染性疾病Tetramer-应用-

8、例证含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关慢性HCV感染患者的特异性CTL