流式细胞术的原理与应用

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1、流式细胞术原理和应用王秀莉2011.9.30一简介二构造及工作原理三FCM的数据分析FCM的应用实例一简介流式细胞仪(FlowCytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均

2、值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒举例：细胞周期分布检测流路(液流系统）流动室鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计（分析系统）计算机二构造及工作原理流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信

3、号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。液流系统流动室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系统激光光源：目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光

4、照强度。光学系统信号散射光信号FS细胞大小SS细胞颗粒性荧光信号FL1–FITCFL2–PEFL3–ECDFL4–PC5光学系统散射光信号——细胞大小及颗粒性FSSS光学系统光路（滤片特性）光学系统流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BPFL3(ECD)675B

5、PFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光学系统电路电压调节光电倍增管电压volts增益Gain信号放大方式检测系统电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。检测系统常用荧光染料介绍FITC：绿色525nmPE：橙黄色575nmECD：橙红色610nmPE－CY5：深红色675nmPerCP：深红色675nmPE－CY7

6、：深红色755nm7AAD：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm488nm波长的氩离子激光激发光路补偿FITC/PE/ECD/PC5三FCM的数据分析单参数一维直方图纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。2.双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。3.等高线图4.密度图白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞P

7、NH诊断（CD55、CD59）血小板活化试验1流式细胞术的临床应用四FCM的应用细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡2流式细胞术的科研应用荧光信号的定量可以用平均荧光强度（mean值），荧光信号面积（Area，A）来表示。1）蛋白表达的检测2）DNAAnalysisPIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主动进入细

8、胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的DNA染料02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisCount2N4NG2MG0G1s02004006008001000PIFluorescence2N4NDNAAnalysis3）Apoptosis检测A）DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓