流式细胞术的原理与应用-FACS-aria

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1、流式细胞术的原理与应用FACS:fluorescence-activatedcellsorting大型仪器中心赵彤1以FACSAria为例讲解流式细胞术的原理样本制备和结果分析流式细胞术的应用2流式细胞术的原理3流式细胞术的原理利用激光激发高速匀速运动的带有各种荧光标记的微粒，并检测微粒由此产生的散射光信号和荧光信号来反应微粒的各个参数，并将特定性状的微粒分选出来，再进行分析或培养的技术。4流式细胞术的特点研究对象：细胞的群体信息（比例值、平均荧光强度）分析速度快：10万个细胞/秒

2、分选纯度高：99%以上可同时检测细胞的多种信息：细胞膜（浆、核）5BDFACSAria6光路系统激光器荧光收集系统7光路系统：激光光源已有激光器：488nm（蓝）,633nm（红）、405nm（紫）准备增加的激光器：375nm（紫外），561nm（橘红），等。8荧光信号收集系统407nm633nm488nm9荧光信号收集系统滤光片置于荧光探测器前，限定其接收不同的荧光范围Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460

3、500540LP500SP500BP500/5010光信号变成电信号光电倍增管PMT：连接光路系统和计算机分析处理系统。把光学信号转换成电子信号通过一定比例进行信号放大11FACSAria各通道的配置检测器排列LP镜片BP滤光片可用染料（激光）12BDFACSAria13样品进入鞘液液滴振荡器进入激光照射点喷嘴液流驱动系统：鞘液（PBS）包绕着单行排列的细胞依次高层流速通过流动室，而激光聚焦于流动室中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。鞘液鞘液样本14流式细胞术分选的原理喷嘴

4、处的高频振荡器，使液流形成上段连续、下段独立的液滴，系统判断断点处的液滴是否是目标细胞，应分选到哪一路，给液滴带上相应的电荷，液滴经过电压场后，发生偏转，落入到相应的收集管中。151.流动室2.电偏转板3.细胞收集器16分选的收集系统多样二路或四路分选装置：5ml管、15mL管ACDU装置：微孔板：6、8、24、96、384孔、载玻片17微孔板任意位置上分选任意数量的细胞，每孔可分选1~10万个细胞，做到精确的“点对点”分选绿色荧光微球sort后，在confocal下观察（李春立老师观察）1

5、8以BDFACSAria为例液流车：鞘液桶、废液桶、水桶、次氯酸钠桶19样本制备和结果分析20检测的微粒样本微粒：只要是一定大小的单细胞悬液均可分析动物细胞、微生物（大肠杆菌、酵母菌）、植物细胞（核）、吸附蛋白beads样本要求：106（大细胞、肿瘤细胞）～1×107（菌）个/ml，约0.5～1ml300目筛网过滤21膜表面抗原染色（荧光素标记抗体+样本）溶血细胞膜表面标记（溶血素，去红细胞）标记洗涤抗体固定与细胞膜打孔的步细胞内抗原染色骤（荧光素标记抗体）细胞内或核内抗原标记洗涤上机

6、22标记荧光素偶联抗体的方法直接标记法间接标记法间接标记-生物素染色法荧光素偶联的抗体1、未标记的一抗1、生物素偶联一抗+抗原+抗原+抗原特异性强，操作步骤少2、荧光素偶联的二抗2、荧光素偶联链霉亲和素+生物素多通道分析时，节约抗体种类2323488nm520nm常用荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC）蓝色激光(L1)绿色FITCAlexaFluro488PEPI488nm黄色红色PE-TexasRedPE-Cy5PerCP远红PerCP-Cy5.5红外PE-Cy7红色激光(L2)红色APCA

7、lexaFluro647633nm红外APC-Cy7紫色激光(L3)蓝色AlexaFluro405PacificBlue405nm绿色AmCyanBDHorizonV50024荧光素的选择选择正确的荧光素：多荧光染料同时使用时要选择光谱重叠少(不同荧光通道）的染料FITC、GFP、CFSE荧光素的荧光通道(PMT)相同，不能同时标记一个样品荧光素强度：PE＞FITC＞PerCPPE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广25信号检测散射光信号（FSC、SS

8、C）：FALSSensor物理参数FreqFluorescenceFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)荧光信号：非特异荧光+特异荧光26散射光信号前向角散射光信号（FSC，ForwardScatter）：与激光方向同轴侧向角散射光信号（SSC，SideScatter）：与激光束垂直27前向散射光信号(FSC)前向散射光信号（FSC）：与细胞相对大小和体积相关28侧向散射光信号（SSC)侧向角散射光（SSC）:代表细胞内部的精细结构变化，对胞膜、胞质、核膜变