RNA提取及常见失败原因

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1、RNA提取及常见失败原因 　　目的　　研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT-PCR、cDNA库构建和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。　　主要试剂　　Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。　　1.Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。　　2.RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意配带手套，样品尽可能盖严；　　3.细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗

2、粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。　　4.酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。　　2-8℃避光保存一年。　　准备工作　　RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。　　1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴2.手套RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造　　商的要

3、求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。　　3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理　　（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不　　必再处理。　　处理的步骤如下：　　Ø在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）　　Ø将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜。　　Ø

4、将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。　　Ø灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。　　（2）玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上。　　DEPC(二乙基焦碳酸酯)　　ØDEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。　　ØDEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。　　Ø试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。　　Ø但DEPC能

5、与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。　　实验步骤如下：　　1.取50~100mg的组织,加入1mlTrizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。　　2.将匀浆室温放置5min。　　3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min。　　4.12000rpm，4℃离心15min。　　5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）　　6.12000rpm，4℃离心15min。　　7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失

6、。　　8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）　　9.8000rpm，室温离心10min。　　10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。　　11.真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。　　12.沉淀用30μlDEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。　　13.RNA检测　　(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/mlRNA计算RNA的产量。　　OD260/OD280在1.8-2.0。　　(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情

7、况。低得率A．样品裂解或匀浆处理不彻底B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解 A260/A280<1.65 A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而  是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。B．样品匀浆时加的试剂量太少。C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。D．水相中混有有机相。E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解 A．组织取出后没有马上处理或冷冻B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-