优化的前处理方法可以提高NSCLC患者的ctDNA的KRAS突变检出率

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1、优化的前处理方法可以提高NSCLC患者的ctDNA的KRAS突变检出率介绍利用ctDNA进行非侵入性的突变检测具有很大的应用前景。这可以为无法获得组织标本的患者提供更多的治疗选择。材料和方法我们分析了45例NSCLC患者的血液和组织的匹配情况。我们研究了DNA提取相关因素对KRAS突变检测的影响：样本收集管，孵育时间，离心步骤，血浆提取量和DNA提取试剂盒。结果2小时的孵育时间，两次血浆离心分离（2000xg）可以降低总DNA的污染。同72小时后采用EDTA抗凝管收集的全血相比，cfDNA专用采血管收集的全血污染概率更低、KRAS突变检出率更高。血浆收集量和不同类型

2、的DNA提取试剂盒均可影响DNA的提取量。结论本研究显示较好的前处理步骤可以获得高质量的用于NSCLC患者突变检测的ctDNA。开发标准的用于KRAS突变检测的标本ctDNA提取方法可以降低前处理步骤对突变检出率的影响。利用cfDNA专用采血管进行快速的标本处理是有益的。结果不同的血浆处理步骤提取的DNA质量为了验证是否存在不同的血浆处理方法会导致不同的gDNA污染水平，我们收集了20例NSCLC患者的血浆，并按照不同的方法进行处理（图1A和图2）。采用EDTA抗凝管和较长的孵育时间可以显著提高DNA的提取量（p<0.01），平均值±SD：EDTA抗凝管2h孵育（2

3、.46±1.60ng/μL）对比EDTA抗凝管72h孵育（15.12±16.44ng/μL）（图2A）。采用cfDNA专用采血管72h孵育提取出的DNA量（3.31±1.82ng/μL）比cfDNA专用采血管2h孵育提取出的DNA量（2.39±1.42ng/μL）具有显著性的提高（p<0.01）（图2B）。当血浆处理时间超过2h时，采用任意一种采血管提取出的总DNA并没有显著性差异（2C）。采用cfDNA专用采血管血浆孵育72h提取出的DNA量远低于采用EDTA采血管同等处理条件下提取出的DNA量（p<0.01）（图2D）。进一步分析每个亚组单次离心和两次离心对患者

4、标本DNA提取量的影响（图2E和图2F）。血浆2h两次离心提取出的DNA量并没有比血浆1h单次离心提取出的DNA量有显著性的提高（图2E）。但是，当样本放置72h后，双次离心（19.35±24.3ng/μL）较单次离心（35.47±32.1ng/μL）相降低了提取DNA的平均量。5个样本中的4个样本提取出的DNA有所降低，但这种差异并不显著（P=0.058）（图2F）。总体分析，这些结果表明优化的血浆处理步骤可以影响DNA的提取水平。图2.血浆处理方法对比。收集20例NSCLC患者的全血，用不同的采血管、孵育时间和离心次数进行处理。将其中一个亚组患者（N=5）全血的

5、单次离心和两次离心步骤的进行对比。用ABI的TaqMan探针检测提取DNA的量。A：EDTA采血管收集的全血，孵育2h或者72h。B：cfDNA专用采血管收集的全血，孵育2h或者72h。C：EDTA采血管或cfDNA专用采血管收集的全血，孵育2h。D：EDTA采血管或cfDNA专用采血管收集的全血，孵育72h。E：EDTA采血管收集的血液孵育2h，单次或双次离心进行处理。F：EDTA采血管收集的血液孵育72h，单次或双次离心进行处理。每例患者的处理结果均列在图中。采用t检验进行统计分析；**p<0.01。不同血浆处理步骤的KRAS突变检测不同的血浆处理步骤也被用于研

6、究20例患者的KRAS突变检测（图1A）。从任何血浆前处理步骤中获取的DNA均用于KRAS突变检测，并同凯杰的therascreenKRAS突变检测试剂盒检出的FFPE组织标本阳性的患者进行对比（n=10/20；数据未显示）。在该队列研究中，cfDNA专用采血管血浆孵育2h的标本KRAS突变一致率为50%（n=5）而同等条件下血浆孵育72h的阳性一致率为40%（n=4）。然而，同非最优处理方法相比，突变的阳性检出率有所下降。同一患者标本，EDTA采血管血浆孵育2h处理后的标本阳性检出率为40%（n=4），同等条件下血浆孵育72h处理后的标本阳性检出率为20%（n=2

7、）（表1）。10例血浆标本的CT值、KRASDNA总扩增数（KRAS控制组）和ΔCT值见表S1。根据凯杰的therascreenKRAS突变检测试剂盒说明书判定KRAS突变状态，突变标本的ΔCT值临界值为6.6-8。由于携带有KRAS突变的ctDNA可检测的标本数量较少，无法进行显著性分析。表1.NSCLC患者的血浆KRAS突变检测总的可扩增的KRASDNA（KRAS控制组）在所有DNA标本中具有相似的趋势（图2）（表S1）。非最优条件下提取出的DNA的CT值较低，这表明此条件下提取出的DNA受到了较大的污染；平均CT±SD分别为：EDTA采血管孵育2h（29.