实验四沉淀反应陈兆云

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1、实验四沉淀反应双向扩散与免疫火箭电泳实验课重点掌握：1.双向免疫扩散实验手工操作过程2.火箭电泳原理及影响因素熟悉：1.双向免疫扩散实验结果分析2.火箭电泳实验操作过程实验一、双向扩散实验原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入10ul血清与抗血清，放置湿盒37℃18～24h后，观察孔周围是否出现沉淀环。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一双向扩散

2、试验（平板法）试剂与器材1.抗原：人血清2.抗体：抗人IgG血清3.生理盐水（1：2~1：64系列倍比稀释）4.用生理盐水和琼脂粉配成1.1%的琼脂5.5*5cm的洁净培养皿6.水浴箱，锥形瓶，打孔用小吸管移液器和酒精灯等实验一主要步骤琼脂加热制琼脂板37度24小时打梅花孔加血清与抗血清观察结果应用1.抗体效价的滴定2.抗原或抗体纯度的鉴定双向扩散试验（平板法）琼脂抗原抗血清实验一注意事项1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在1~1.5mm（视线要在平皿侧面观察）。2.打孔时要等琼脂完全冷却后，垂直打孔。3.

3、用针挑去孔内琼脂时要小心损伤孔边缘。4.孔内加样要准确，不得使加样头碰到琼脂孔边缘。5.平皿要始终水平操作。结果分析A.Ag、Ab浓度及分子量相近；B.Ag、Ab浓度相近，分子量AgAb;D.浓度Ag>Ab,分子量相近;E.浓度Ag>Ab,分子量AgAb电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体

4、浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。原理单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术实验二、火箭免疫电泳试剂与器材1.抗原：人血清2.抗体：抗人IgG血清3.水浴箱，锥形瓶，移液器等4.琼脂糖电泳槽5.PH8.6巴比妥缓冲液实验二主要步骤PBS混合琼脂55℃+抗血清制琼脂电泳玻璃板电泳槽加PH8.5PBS取点样梳电泳5~6小时梳井内加血清观察结果PH8.6的巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，凝固后取下点样梳，在梳井孔内加10ul标准血清及待测样品血清，梳井样品孔放负极侧，电泳仪调节电势梯度5~6V/cm，电流

5、3~4mA，电泳5~6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。技术要点火箭免疫电泳1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形.4.IgG相反方向的电渗作用。5.加样和琼脂中抗血清的浓度。影响因素火箭免疫电泳火箭免疫电泳图①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本-+火箭免疫电泳示意图定量结果判断1.将待测电泳峰高度与1、2、3标准浓度血清对比得出浓度。2.将标准血清浓度与峰值高度绘制曲线图，根据待测电泳峰高度，查处相应浓度。实验二注意事

6、项1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在1~1.5mm，倒满整个玻璃挡板范围内。2.要等琼脂完全冷却后，先从一侧慢慢取下点样梳。3.加样要准确，要加到梳井孔内。4.悬空加样，通电后不得用手触及电泳环境中的缓冲液。5.电泳一段时间后注意观察火箭沉淀现象。火箭电泳应用的意义火箭电泳作为抗原定量只能测定ug/ml以上的含量，低于此水平则难以形成可见的沉淀峰，若是使用少量125I标记抗原或抗体，即使含量低火箭峰不可见也可使用X线胶片显影的技术显示火箭峰，测出ng/ml的含量浓度。思考题火箭电泳实验结果不好,常会有哪些

7、影响因素,分别造成什么样的电泳图?实验报告实验一1.实验报告标准格式2.梅花孔图文描述（抗原与抗体复合物位置、形状及代表意义；抗体效价浓度比例）实验二1.实验报告标准格式2.火箭形状描述，失败或结果不好的原因3.定量结果（与3个标准血清峰比较大致含量）以上均以书面和图形表示在实验报告中实验标本分类实验一1.美国贝克曼羊抗人血清igG试剂（每个大试验台2支子弹头）共8支2.人血清标本（每个大试验台2支子弹头）共8支3.5*5平板每人一个共56个4.打孔吸管和挑取针（每个大试验台3附）5.琼脂锥型瓶4个（每个大试验台1

8、个）实验标本分类实验二1.人标准血清1，2，3，和标本血清1，2，3，4，5共四份全体实验学生共同配合使用。2.火箭电泳漕两个，课堂由学生制作电泳琼脂板四个。3.四块电泳琼脂板分四个大实验台学生自行加样跑电泳。整组统一操作，每组一名组织人。