细菌鉴定中常用的生理生化反应

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1、细菌鉴定中常用的生理生化反应陈金春,林琳，郑重，陈晶瑜，王亚武清华大学微生物实验室,100084实验目的和内容a.了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；b.通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；c.了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；实验原理细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。实验原理－－细

2、菌生化试验糖(醇)类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5．2(黄色)一6．8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。实验原理－－细菌生化试验甲基红(Methylred)试验(该试验简称MR试验)很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4．2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范

3、围是pH4．4(红色)～pH6．2(黄色)。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基的pH仍在6．2以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。实验原理－－大分子物质代谢实验靛基质(吲哚)试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。实验原理－－大分子物质代谢实验明胶液化实验某些细菌具有胶原酶

4、，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。实验原理－－有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色

5、变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。实验仪器,材料和用具实验仪器37℃恒温培养箱、20℃恒温培养箱（室温代替）。微生物材料大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1支。试剂甲基红试剂、V．P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂(硝酸盐利用试验)、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)实验仪器,材料和用具实验用具试管：每份每个试验2根试验，1根对照，8个试验共27根。无菌乎皿：每份2个杜氏小管：每份6个。接种环、酒精灯、试管架、记号笔。实验仪器,材料和用具培养基葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：每份各6支试管，每支5～10mi培养基，灭菌。用于糖类发

6、酵试验。葡萄糖蛋白胨水培养基：每份3支试管，每支5～10mi培养基，灭菌。用于甲基红和V．P试验。胰蛋白水培养基：每份3支每支5～10mi培养基，灭菌。用于吲哚试验。柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基；每份3支，每支5～10ml培养基，灭菌。用于硫化氢试验。营养明胶培养基：每份3支，每支．5～10ml培养基、灭菌。用于明胶液化试验。淀粉培养基：每份2个平皿，每平皿约20ml培养基，灭菌后倒入平皿。用于淀粉水解试验。柠檬酸钠培养基：每份3支，每支5一lOml培养基，灭菌，做斜面。用于柠檬酸盐利用试验。实验步骤糖(醇)类发酵试验编号在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下

7、同。接种取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。将已接种好的培养基置37℃温箱中培养24h。观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体。气体占整个倒置小玻管的10