细菌的生理生化反应

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1、实验十细菌的生理生化反应一、  目的1.1了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法二、  原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同微生物因具有不同的酶系统，分解利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，其发酵的类型和产物也不相同。细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中有很大作用。三、  材料3.1菌种大肠杆菌（Escherichia coli）产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）普通变形杆菌（Proteusvulgaris）枯草芽孢杆菌（Bacillussubti

2、lis）的斜面菌种3.2培养基　糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基、H2S试验培养基、柠檬酸盐培养基3.3试剂V.P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、碘液。3.4器具恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。四、步骤(一)糖类发酵试验（二） 乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)（三） 甲基红试验（M.R.试验）（四）吲哚试验（五）柠檬酸盐试验（六）硫化氢试验（七）淀粉水解试验(一)糖类发酵试验原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产

3、酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌培养基：葡萄糖发酵培养液、乳糖发酵培养液试管步骤1试管标记取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、普通变形菌。2接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。置37℃恒温箱中培养，培养24h-48h，观察结果。与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳

4、性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。结果观察（二） 乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)原理某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V.P（+）反应。材料菌种:大肠杆菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）培

5、养基：葡萄糖蛋白胨水培养液步骤1标记试管:取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置37℃恒温箱中，培养24～48h。取出以上试管，振荡2min。加入等量V.P试剂；振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min。若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。结果观察（三） 甲基红试验（M.R.试验）原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮

6、酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.2以下，使甲基红指示剂变红。材料菌种　同V.P试验培养基　同V.P试验步骤同V.P试验1标记试管:取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置37℃恒温箱中，培养24～48h。取出以上试管，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层。若培养液上层变成红色，即为阳性反应，用“＋”表示；若仍呈黄色，则为阴性反应，用“－”

7、表示。结果观察（四）吲哚试验原理:有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。材料菌种：同V．P试验培养基：蛋白胨水培养基试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。步骤1试管标记:取装有蛋白胨水培养液的试管2支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，置37℃恒温箱中培养24～48h。取出以上试管，在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片

8、刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察）。如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。结果观察（五）柠檬酸盐试验原理有些