蛋白质类药物分析

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1、第九章蛋白质和多肽类药物的分析第一节概述一、蛋白质和多肽重要理化性质二、蛋白质和多肽类药物质量控制标准三、蛋白质和多肽类药物的活性及测定方法一、主要理化性质高分子特性：是其胶体性、变性和免疫学特性基础两性解离与等电点：影响多肽、蛋白质分离、纯化和分析颜色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应紫外吸收：280nm处最大吸收，可定量蛋白质和多肽（一）高分子特性是其胶体性、变性和免疫学特性的基础1、胶体性质可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带

2、有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体（Φ1-100nm）。疏水色谱2、变性与复性蛋白质高级结构是其理化特性及生物学功能基础。当蛋白质受某些理化因素影响，其分子内原有高级构象发生变化，蛋白质理化性质和生物学功能改变或丧失，但一级结构未变，即变性作用(denaturation)表征：生物活性丧失；物理（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性）和化学（化学反应，被酶解性）改变.生物活性3、凝集（Aggregation）（二）两性解离与等电点影响多肽、蛋白质分离、纯化和分析（三）颜色反应可用于蛋白质定量与定性分析1）茚三酮反应2）双

3、缩脲反应3）酚试剂反应双缩脲反应红紫色络合物(碱性溶液)Cu2+（四）紫外吸收蛋白质和多肽组成中常含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰二、蛋白质和多肽类药物质量标准（一）原液质量标准（二）成品质量标准（一）原液质量标准生物学活性、比活性（见药典附录ⅩC）蛋白质含量（见Chp附录ⅥD）纯度：≥95%，非还原SDS-PAGE（见Chp附录ⅣC）、HPLC法（见Chp附录ⅢB）分子量：还原型SDS-PAGE法（见Chp附录ⅣC）、质谱法外源性DNA残

4、留量：≤10ng/剂量（见Chp附录ⅨB）宿主蛋白残留量：≤0.1%，0.05%（见Chp附录ⅨC）残余抗生素：不得检出（见Chp附录ⅨA）细菌内毒素：≤10EU剂量（见Chp附录ⅫE凝胶限量试验）结构确证：等电点（见Chp附录ⅣD）、紫外吸收光谱扫描（见Chp附录ⅡA）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见Chp附录ⅧE）、氨基酸组成（二）成品质量标准鉴别试验：免疫印迹或斑点法，阳性物理检查：外观、可见异物、装量化学检查：水分、pH值生物学活性：标示值的%范围无菌检查：不得检出内毒素检查：≤10EU剂量异常毒性检查：符合规定三

5、、蛋白质和多肽类药物活性及测定方法（一）生物学活性及比活性测定（二）生物学活性测定方法分类（三）生物学活性测定方法选择（四）生物学活性测定（五）蛋白质药物的比活性（一）生物学活性及比活性测定检测意义获取准确的效价信息，保证产品有效效价：有效性指标，反映药品效力生物学活性才能真实反映生物技术药效价原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致生物制品技术药:单位（U、AU、IU）（二）生物学活性测定方法分类1、动物基础的活性测定1）离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉2）体内测定法：EPO的小鼠网织红细胞2、细胞基

6、础的活性测定1）促细胞生长法：大多数细胞因子类2）抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂3）间接保护细胞法：IFN保护WISH3、酶学基础的活性测定：重组酶类4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：抗原决定簇与活性中心常不一致（三）生物学活性测定方法选择1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法2、细胞染色标记方法：MTT＞3H-Thymidine＞流式细胞仪（测细胞周期）3、定量法＞半定量法＞定性法4、生物学活性不一定与临床药效类型一致工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。如rh-GH用HPLC（四）生物学活性测定（Chp附

7、录ⅩC）样品：原液、成品标准：不同生物活性测定方法的规定标准测定方法规定标准动物基础的活性测定70%~130%标示量细胞基础的活性测定80%~120%标示量酶学基础的活性测定85%~115%标示量结合反应的活性测定85%~115%标示量（五）蛋白质药物的比活性样品：原液定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性单位（IU/mg）意义：真实反映有活性的蛋白质所占的比例，厂家间、表达系统间、批间比较便于配制成品第二节蛋白质和多肽类药物分析一、鉴别二、结构确证三、检查四、含量测定五、残余杂质检测六、安全性及其他检查一、鉴别鉴别药物的真

8、伪（一）化学鉴别：双缩脲反应（是否蛋白质/多肽类）（二）紫外吸收光谱扫描（Chp附录ⅡA）样品：原液方法：紫外扫描标准：最大吸收波长与特征波长一致、批与批间一致一级结构不含芳香族氨基酸重组药物，在280nm附近没有最大吸收峰，可不做紫外吸收光谱测定重组脑利钠肽(rhBNP)（三）免疫印迹方