蛋白质类药物的分离纯

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1、四.生物药物的制备3.蛋白质类药物的分离纯化方法生产过程上游构建（基因工程）发酵生产(发酵工程)纯化制备●来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；●分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。蛋白质的分离纯化产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间1）蛋白质的基本特性蛋白质分子中存在游离氨基和羧基，具有两性解离性质。当蛋白质溶液处于某pH时，蛋白质分子解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质

2、的等电点pI。①两性解离与等电点利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。蛋白质分子量很大，分子粒径为1～100nm，属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定亲水溶胶的两个重要因素。②蛋白质的胶体性质③蛋白质的沉淀蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来蛋白质沉淀——蛋白质的肽链相互聚集，从溶液中析出。++蛋白质胶体颗粒的沉淀++++-------+-（沉淀）（疏水胶体）

3、（疏水胶体）●沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化，在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。●是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。●去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活性。蛋白质的非变性沉淀核糖核酸酶可逆变性在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以是变性沉淀。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。蛋白质的变性沉淀盐析电泳透析层析分子筛超速离心2）蛋白质的分离纯化方法定义：加入

4、大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。优点：Pr不变性，常用。①盐析（Saltingout)定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反方向泳动的现象叫电泳。原理：●Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。●不同Pr分子携带电荷量不同，分子大小也不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。②电泳（electrophoresis)电场中，带净电荷Q的粒子所受电荷引力：溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻：当F引=F

5、阻时：●粒子泳动速度V与场强E、粒子电量Q成正比；●V与粒子半径r、溶液粘度η成反比；●V与粒子形状有关。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力。电泳过程示意图A.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE）以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，吸附和电渗作用小，是很好的电泳支持介质。丙烯酰胺——单体N，N’-甲叉双丙烯酰胺——交联剂催化合成CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺CH2

6、=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=OCH2-CHCH2¯CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点凝胶由上、下两层凝胶组成上层——大孔径浓缩胶，浓度2～3％；下层——小孔径分离胶，浓度5～15％；缓冲液中主要阴离子——Gly-,Cl-；凝胶pH不同电极缓冲液——pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；浓缩胶——pH6.8的Tris-HCl缓冲

7、液；分离胶——pH8.9的Tris-HCl缓冲液；三种物理效应——样品浓缩效应，凝胶分子筛效应，电荷效应。——分离效果好，分辨率高。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%板状电泳B.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（SDS）时,电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接由电泳迁移率计算蛋白质分子量。SDS的作用原理阴离子SDS能与蛋白质结合。当SDS总量为蛋白量的3～10倍、且SDS单位浓度大于1mol./L时，两者的结合是

8、定量的，每克蛋白质约结合1.4克SDS。蛋白质分子结合SDS后，所带负电荷的量远远超过其原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷负荷的差异。蛋白质-