SDS-PAGE-论文

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1、2.4.7测定米糠解脂酶的相对分子量本实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定米糠解脂酶的相对分子量[14]。购买标准Marker蛋白做标准曲线，标准蛋白分子量范围为14.4kD~97.4kD。2.3.7.1试剂准备：i.30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100mL热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃保存。ii.1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）溶液iii.10%SDS溶液：10%（W/V），4℃保存，用时加热溶解iv.10%过硫酸铵：称取AP1g，

2、加重整水定容到10mL，现用现配v.TEMED溶液：1%(V/V)，4℃保存vi.0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）溶液vii.Marker标准蛋白样品缓冲液：0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）溶液2.0mL甘油（丙三醇）2.0mL20%（W/V）SDS2.0mL0.1%(W/V)溴酚蓝0.5mLβ-巯基乙醇1.0mL重蒸水2.5mLviii.待测样品缓冲液：0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）溶液1.0mL甘油（丙三醇）1.6mL10%（W/V）SDS1.6mLβ-巯基乙醇，

3、0.4mL0.05%（W/V）溴酚蓝0.4mLix.电极缓冲液（5×）：称取45.0gTris，216.0g甘氨酸和15.0gSDS用重整水定容到3L，4℃保存，使用前37℃加热。x.固定液：冰乙酸∶甲醇∶水=1∶2∶7xi.考马斯亮蓝R染色液：每100mL甲醇、水、冰乙酸混合物（9∶9∶2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，过滤除去未溶物。xii.脱色液：甲醇∶水∶冰乙酸=9∶9∶22.3.7.2操作步骤如下：1、准备步骤1）将凝胶板依次用水、无水乙醇洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。2）试样格（梳子）临用前用

4、无水乙醇擦拭，让其挥发至干。3）灭菌枪头、eppendorf管。2、制备凝胶1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。2）配制12%的分离胶（10mL）：依次将4.0mL30%丙烯酰胺贮存液，3.35mL双蒸水，2.5mL1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）溶液，0.1mL10%SDS溶液，50μL10%过硫酸铵，5μLTEMED混合，一定要搅拌均匀。3）灌胶：迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。用移液枪小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。4）在分离胶聚合的

5、过程（约40min）中，配制4%的浓缩胶（5mL）：依次混合3.05mL双蒸水，650μl30%丙烯酰胺贮存液，1.25mL0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）溶液，50μL10%SDS溶液，25μL10%过硫酸铵，5μLTEMED（TEMED应在灌胶前才加入）。5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。3、样品的制备在

6、标准蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，使蛋白的终浓度为3-4mg/mL，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。待测蛋白按1体积待测蛋白溶液加3体积样品缓冲液，混合后在沸水浴中加热3分钟，冷却后上样。4、上样用微量进样器上样，上样量为15μL左右。每加入一种样品，应在双蒸水和电极缓冲液中洗涤加样器数次。5、电泳向电泳槽内加入适量电极缓冲液，使内槽电极缓冲液没过短玻璃板5mm，外槽液面较内槽低约10mm打开电源，初始电流为10mA(电压为40V)；当染料进入分离胶（这段时间约为2h）后，将电流提高到20m

7、A(电压为80V)，继续电泳直至染料到达离凝胶底部0.5cm处。6、后处理1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。2）染色：除去固定液，加入染色液（用量同上），摇床缓慢振荡染色1h。3）脱色：将凝胶板浸泡于脱色液中，至背景脱至无色，其间需更换脱色液3～4次。7、观察记录结果、绘制Marker蛋白标准曲线，并对凝胶进行扫描照相。