BIO-RAD荧光定量PCR——科研培训材料

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1、荧光定量PCR原理和方法介绍陈寅清BIO-RAD,CHINAJune,2005提纲荧光定量PCR的原理和应用荧光定量PCR实验的设计和优化仪器软件的操作和仪器的维护引物和探针的设计常见问题及解决方案荧光定量PCR的原理PCR反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重复退火5’3’5’3’5’3’5

2、’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循环24个拷贝循环38个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’Cycle#TheoreticalRealLifeLogTargetDNAPCR反应模式RelativeFluorescence终点检测InAddition同一样品重复96次的实验结果Lockeyetal.(1998)Biotechniques24:744-6终点法和实时法的结果比较实时PCR（realtimeP

3、CR）能够在扩增的同时对扩增产物的量测量或定量。CTCt值的设定扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。1)设定基线2)设定阈值3)CT值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。阈值设定的越高，CT值越大。CycleCt值和起始模板量的对应关系Templateabundancein6samples.23.823.723.6LowCt,highamount35.635.335.2HighCtlowamountCorrelationCoefficient,SlopeandPCREfficie

4、ncy(cont.)相关系数标准曲线的斜率和扩增效率相关Efficiency()=[10(-1/slope)]-1荧光PCR的原理插入染料法杂交探针法5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’插入染料方法的原理插入染料TaqIDl延伸5’3’5’3’5’3’5’3’检测激发的荧光5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’退火IDIDIDIDIDI

5、DIDIDIDIDlllll相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜不需要特别设计探针SYBRGreenI,最常用的插入染料SYBRGreen染料插入双链DNA，检测灵敏度提高1000倍。和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低。不能做多重PCR。插入染料能够和引物二聚体和非特异性扩增产物结合杂交探针方法TaqMan探针分子信标探针（MolecularBeacons）FRET探针TaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’

6、反应体系变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ5’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.链取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.检测荧光5’3’3’QTaqR5’l产生很强的荧光信号容易设计和合成可以做多重检测能够进行SNP(SingleNucleotidePolymorphism)检测比插入染料贵Tm值比引物高10℃长度不超过30bp5’端不能是GTaqman探针设计5’5’3’3’d.N

7、TPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分分子信标(MolecularBeacons)变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taq5’3’RQRQMolecularBeacon5’3’5’3’5’3’1.链替换Taq5’2.聚合完成l5’3’RQ退火5’3’RQ5’3’3’5’TaqRQMolecularBeaconSNP检测，较Taqman探针有更大的温度选择性多重PCR难设计和合成产生的荧光信号较低价格昂贵5’5’3’3’d.N

8、TPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分FRET探针变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taq5’3’RQDRFRET探针5’3’5’3’l3’DR5’退火5’3’链替换,荧光熄灭5’3’3’5’Taq3’DR1-5basesDRTaq5’R5’特异性好SNP检测难设计费用昂贵TexasRed,ROXCY3.5,RedmondRed常用的荧光基团FAMTET,VIC