《(最新)中山大学基础医学院周俊宜工具酶（周俊宜）》

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1、分子克隆技术常用的工具酶中山大学基础医学院周俊宜fzyxzjy@126.com基因组DNA目的基因目的基因基因载体重组体(复制子)基因重组核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶第一节限制性核酸内切酶5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能在特异位点（酶切位点）上催化

2、双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。存在于细菌体内。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）电泳一、限制酶概念提出的背景20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。1962年，W

3、．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶.EcoliK株噬菌体EcoliK株其他Ecoli菌株限制现象限制性内切酶能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。NNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNN

4、NNNNNNNNNNAluⅠ5’3’二、限制性核酸内切酶的分类根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。I类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。Ⅱ类：基因工程的工具酶。Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp～27bp，对分子克隆操作亦无实用意义。三、限制性核酸内切酶的命名原则限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系

5、，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。如HindⅢ代表从流感噬血杆菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分离到的第3个限制酶。四、Ⅱ类限制性核酸内切酶1一般性状分子质量为60ku，单链多肽，最适pH为6～8；NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用，对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。2识别序列它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4bp～6bp，有些则为7bp～8bp

6、，甚或多于8bp。多数限制酶的识别序列为回纹结构，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。3酶切切口有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端；很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些为3’-突出的粘性末端。这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子。5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-

7、3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）4．贮存与应用限制酶对热

8、不稳定，贮存于-20ºC，为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。5影响限制酶活性的因素1）“星”活性酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。EcoRⅠ：GAATTCEcoRⅠ*：AATT2）甲基化识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。3）底物性状4）试剂：缓冲系统6限制片段末端的连接作用5’NN