实验二 pcr扩增乙肝病毒基因及rapd

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1、分子医学技能杨霞中山医学院生化教研室yangxia@mail.sysu.edu.cn实验二PCR扩增乙肝病毒基因及电泳检测RAPD技术及基因多态性分析课堂设计PCR扩增乙肝病毒基因实验操作PCR反应（约2h）琼脂糖凝胶板制备PCR产物电泳检测（40min）PCR产物电泳检测（40min）上午下午RAPD-PCR扩增实验操作PCR反应（约3.5h）琼脂糖凝胶板制备结果观察一、RAPD－PCR反应（P400）每组3-4人，其中2人用自己基因组DNA做一个随机引物PCR反应，用同学的基因组DNA做模板。ddH2O15.2μl10×PCR缓冲

2、液2.5μl引物1.5μldNTPs2μlDNA模板3.5μlTaqDNA聚合酶0.3μl总体积：25μl（1）PCR反应体系（2）PCR程序94℃5min（预变性）94℃60’’（变性）38℃60’’（复性）共40个循环72℃1min（延伸）72℃10min（续延伸）4℃保存每个同学只需向PCR反应管中加入引物和DNA模板即可放入PCR仪上二、PCR试剂盒检测HBVDNA实验操作及注意事项实验分组（每组做1管待测血清，第1和6组分别做1份阳性模板）待测血清40ul+40ulDNA提取液，混匀沸水浴10min，10000rp

3、m×5min待测血清组取上清2l加入一PCR反应管；阳性模板组取阳性模板2l加入一PCR反应管6000rpm×5s，混匀P26：全班做4份（2组做1份）93℃×3min预变性94℃×30s，55℃×30s，72℃×45s重复30个循环72℃保温5min三、PCR基本原理及相关知识概述聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片段的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医

4、学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。PCR扩增DNA片段的原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：①变性：加热，模板DNA形成两条单链②退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合③延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109倍。通过循环可以提高PCR

5、的特异性。PCR反应体系的组成及功能PCR的完成是在一个0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，PCR引物设计的原则：P22；目的是提高扩增的效率与特异性。终浓度为0.1~0.5umol/LTaqDNA聚合酶有良好的热稳定性，具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性.因此,它对核苷酸的错配没有校正功能。其活性对Mg2+浓度非常敏感终浓度一般为：2.5u/100ul模板DNA相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板

6、纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。dNTP：已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。10×PCR反应buffer：已作成商品化的产品，它包括：250~500mmol/LKCl；100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）；0.1%明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积液体石蜡油影响PCR的主要因素①PCR反应

7、体系的各个组分②PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）③PCR循环的次数和平台效应④操作环境RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术该技术是利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，电泳分离来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、胶3mm、凝固后拔梳）1％琼脂糖胶2块，倒缓冲液，加样（取RAPD-PCR产物8μl+

8、2μl上样缓冲液混匀上样）+6分子量标准电泳（110mA40min）结果观察（紫外检测）四、DNA琼脂糖凝胶电泳1％琼脂糖胶1块，倒缓冲液，加样（取PCR反应管中样品液10μl直接上样）