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1、SDS-PAGE电泳试剂1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100mL,棕色瓶存于4OC；2)1.5MTris-HCl(pH8.8)：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；3)1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100mL；4)4´分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5MTris-HCl(pH8.8)，定容至100mL
2、；5)4´浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1MTris-HCl(pH6.8)，定容至100mL；6)10´电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.029g，甘氨酸14.415g，SDS1g加ddH2O溶解,定容至100mL；7)10%过硫酸铵（Aps,现配）：1gAP加ddH2O至10mL；8)2´SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5mL，b-巯基乙醇1.0mL，SDS0.6g，甘油2.0mL，0.1%溴酚兰1.0mL，ddH2O3.5mL；9)考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.2
3、5g，甲醇225mL，冰醋酸50mL，ddH2O225mL；10)脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11)分离胶(12.5%):ddH2O4mL，30%储备胶5mL，4´分离胶缓冲液3mL,10%Aps0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；12)浓缩胶（5％）：ddH2O2.65mL，30%储备胶0.85mL，4´浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps50μL，TEMED5μL。Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）-SDS-PAGE蛋白质电泳1Trici
4、ne-SDS-PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10×)：14gTris溶于400mL重蒸水,用1.0MHCl调至pH8.9,定容至500mL。2）负极缓冲液(10×)：将60.55gTris,89.58gTricine及5gSDS溶于400ml重蒸水中,加水至终体积为500mL。3）凝胶缓冲液(3×)：将181.5gTris,1.5gSDS溶于400mL重蒸水中,用1MHCl滴定至pH8.45,再加水稀释至500mL。2丙烯酰胺储存液配制1）3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)将48g丙烯酰胺和1
5、.5g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL49.5%的储存液。2）5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉双丙烯酰胺成100mL49.5%的储存液。3Tricine-SDS-PAGE的凝胶制作1）小孔胶3mL:1mL凝胶缓冲液(3x)、0.4g甘油、1mL“6C凝胶储存液”、用去离子水稀释至3mL,临用时加入10ｕL的10%过硫酸氨溶液和1ｕL的TEMED。2）夹层胶3mL:1mL凝胶缓冲液(3x)、0.61mL“3C凝胶储存液”,用去离子水稀释至3mL,临用时加入1
6、0ｕL的10%过硫酸氨溶液和1ｕL的TEMED。3）浓缩胶2mL:0.5mL凝胶缓冲液(3x)、0.16mL“3C凝胶储存液”,用去离子水稀释至2mL,临用时加入10ｕL的10%过硫酸氨溶液和1ｕL的TEMED。用垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小孔胶,接着均匀注入夹层胶,凝胶聚合后再铺浓缩胶。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析1）准备：电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。2）12.5%分离胶灌制取一洁净的20mL烧杯，分别加入：ddH2O4mL30
7、%储备胶5mL4´分离胶缓冲液3mL10%Aps(现配)0.1mL100%TEMED0.01mL轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。3）5％浓缩胶灌制取一洁净的20mL烧杯，分别加入：ddH2O2.65mL30%储备胶0.85mL4´浓缩胶缓冲液1.25mL10%Aps50μL100%TEMED5μL待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。4）上样与电泳将凝胶玻板置于电泳槽中，加入
8、事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分离胶选用120V固定直流电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约3小时。5）染色及脱色电泳结束后，用考马斯亮蓝染液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转2小时，回收染液，用脱色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直至脱色完全后
