sds-page原理、试剂配制和注意事项

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1、SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催

2、化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强

3、度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进

4、行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂实验材料1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:

5、Bis为29:1）：将60ml水预热至37摄氏度，加入丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，溶解并补水至100ml。用0.45微米孔径滤纸过滤，查证溶液pH值不超过7.0。贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。（Acr）29.2g及（Bis）0.8g丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积效应。称量时应戴手套和口罩。2、1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液  取1mol/LHCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8

6、，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液  取1mol/LHCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。100ml分离胶1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：将Tris18.171g完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至8.8，加水定容至100ml。室温保存。100ml积层胶1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：将Tris12.114g完全溶于50ml去离子水中，加HCL调

7、pH至6.8，加水定容至100ml。室温保存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：5*存储液：在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，加入50ml10%（w/v）SDS（电泳级）存储液（SDS5.g），用去离子水补至1000ml。pH8.3。5、10%过硫酸铵（AP）：过硫酸铵0.1g于1.5ml进口EP管中，用时加1ml去离子水溶解。2周内使用。6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）：在900ml水预热至68摄氏度，加入100g电泳级SDS溶解，补水至1000ml。SDS颗粒易扩散，称量时戴面罩。10%SDS无需灭菌。室温保存。7、

8、四甲基乙二胺（TEMED）：10%TEMED0.1mlTEMED,加0.9ml蒸馏水。8、上样缓冲液  取1.0mol/L