《蔗糖酶理论讲授》ppt课件

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1、三、实验步骤及原理1、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的纯化3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响6、蔗糖酶酶促反应动力学研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量11、蔗糖酶的提取(细胞破壁)自溶法破壁（本实验）干酵母粉溶于蒸馏水乙酸钠乙酸乙酯35℃恒温搅拌40分钟35℃恒温过夜补加蒸馏水搅拌均匀，成糊状离心弃沉淀及脂层E1记录生产厂家和批号用硫酸纸封严（过夜）2E1用稀HAC调pH至4.5乙醇分级(32%乙醇饱和度)Ι离心，取上清乙醇分级(47.5%乙醇饱和度)Ⅱ离心，取沉淀

2、透析磷酸缓冲液5mmol/LpH6.0过夜离心，取上清E2E2E3DEAE-52离子交换层析E3E4Sephadex-G100凝胶层析2、蔗糖酶的纯化31.酶的蛋白属性；2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析4.根据酶分子电荷性质的分离方法；离子交换层析5.根据酶分子专一性结合的方法;酶的纯化方法42.调节酶溶解度的方法；酶的纯化方法（1）改变离子强度；盐溶/盐析硫酸铵分级沉淀（反抽提法）（2）改变pH或温度；（3）改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降

3、低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。5有机溶剂分级沉淀操作条件的控制溶剂选择常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。温度使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。样品浓度的控制一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2%为好。63.根据酶

4、分子大小、形状不同的分离方法；酶的纯化方法（1）离心分离；（2）透析、超滤；（3）凝胶层析（gelchromatography）凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析凝胶层析常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。7凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进

5、入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。84.根据酶分子电荷性质的分离方法；酶的纯化方法离子交换层析基本原理：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂93、蔗糖酶的活性测定酶活力(enzymeactivity)酶催化某一反应的能力——VV——单位时间内单位体积中底物(substrate)的减少量或产物(product)的增加量10国际单位（IU）：在特定的条件下，每分

6、钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量。催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。1IU=16.67×10-9kat酶活力单位：2、酶活力和比活力表示方式11活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数(U/mg蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。酶的比活力(specificactivity，也称比活性）比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）

7、比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示12DNS法测定蔗糖酶活力（本实验）1、3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理：DNS试剂+D-葡萄糖氨基化合物（还原糖）强碱性溶液沸水浴（棕红色）2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。1）2、蔗糖酶活力测定的原理：1）蔗糖酶催化的反应是：2）蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。(附1)3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。蔗糖D-果糖+D-葡萄糖蔗糖

8、酶133、DNS比色定糖法工作曲线的制作：①取8支血糖管编号1-8，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（2mg/ml）、蒸馏水、3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀