基因操作及其医学应用2讲义

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1、GENEMANIPUTATIONANDITSAPPLICATIONINMEDICALPRACTICE基因操作及其医学应用鲍朗教授转基因和基因治疗转基因和基因治疗1．概念和研究现状2．基因治疗的基本类型3．转基因的基本方法4.转基因的表达和调控5．基因治疗的运用和前景内容提纲基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。转基因及基因治疗基本概念转基因及基因治疗基因治疗的程序目的基因转基因基因表达基因治疗viralnonviralInvivoexvivo体内调控基因治疗的基本类型★细胞介导的基

2、因治疗(exVivo)是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)。★体外表达基因治疗(inVitro)是传统的基因表达形式。转基因的基本方法非病毒法(Nonviral)病毒法(Viral)和1、病毒法(Viral)1)逆转录病毒(Restrovirus)RNA病毒，结构缺陷PackagingCell转基因及基因治疗转基因的基本方法★体内直接转基因治疗（inVivo）转基因及基因治疗基因治疗的基本类型是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率

3、低。优势：①整合率高;②对外源DNA影响小;③单拷贝整合，利于表达调控；④安全。转基因及基因治疗转基因的基本方法劣势：①容量小;②只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因;③Transiteexpression;④R.V.+P.C+P.C实验室要求高。转基因及基因治疗转基因的基本方法2）腺病毒(Adenovirus)腺相关病毒(Adenoassociatedvirus)DNA病毒E1和E3基因缺乏263细胞系生长转基因及基因治疗转基因的基本方法特点：①能感染静止细胞，体内(invivo)转基因②对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗③包容量大④尚无PackagingCell，欠

4、安全⑤有较强免疫原性，易引起体内免疫反应转基因及基因治疗转基因的基本方法2、非病毒法(Nonviral)1）显微注射法(Microinjection)2)基因定位整合技术(Genetargeting)3)受体介导(Receptor-mediatedmethods)4)组织内直接注射(DirectinjectionofDNA)5)磷酸钙沉淀法(CaPO4precipitation)转基因及基因治疗转基因的基本方法基因定位整合技术（基因打靶GeneTargeting)基因打靶的概念通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶。若定

5、向敲除某个基因，称为基因敲除（geneknockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（geneknockin）。基因打靶的必要条件打靶载体打靶载体中的必要成分：载体DNA目的基因同源片段筛选标志基因neu（新霉素）阳性筛选标志基因；HSV-tk阴性筛选标志基因。胚胎干细胞基因敲除的基本程序1、构建打靶载体A.获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；B.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；C.将neu基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源序列的中间；D.在目的基因同源序列的

6、外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。2、打靶载体导入ES细胞3、基因敲除ES细胞注射入胚泡4、胚泡植入假孕的小鼠子宫中5、嵌合体的杂交育种附表外源DNA的整合转基因及基因治疗转基因的基本方法Table1.Methodsofdeliveringgenesintomammaliancellsandlikelyapplicationsingenetherapy(+).Majorapplication:(+/-),someapplication;(-).Littleornoapplication;T.onlytransientexpression;S.stableexpr

7、essionScience,Vol.260:14May,19931.启动子(promoter)选用或设计适当地强启动子能使外源性基因在宿主体内高效表达。2．内含子(intron)在转基因过程中，内含子可增强基因表达。转基因及基因治疗转基因的表达和调控3．反式作用因子(Trans-activator)能激活不同种外源基因转录，提高转录基因的表达效率。4．载体(Vector)要考虑病毒载体与外源基因之间的相互干扰，必要时切除