基因操作及其医学应用1讲义

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1、GENEMANIPUTATIONANDITSAPPLICATIONINMEDICALPRACTICE基因操作及其医学应用鲍朗教授基因操作的基本策略基因操作的基本策略1.概述2．DNA和基因的近代概念3.基因操作的基本内容和程序内容提纲理论三大发现★生物遗传物质是DNA(Avery，U.S.A．1934)★DNA双螺旋模型(Watson,C.S.H.CrickC.B.1953)★遗传中心法则(Nirenberg，1961-1966)概述基因操作的基本策略技术上的三大发明★限制性内切酶(Smithetal.1970)★

2、载体(Cohen1973)★逆转录机制(Baltimore1970)基因操作的概念基因操作的基本策略定义：在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为DNA重组技术，主要程序是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传物质的新组合，然后转移到宿主细胞中扩增和表达。DNA的生化特性DNA的结构DNA的生化特性DNA的结构DNA的生化特性DNA的半保留复制RNA的生化特性mRNAmRNA占细胞RNA总量的1%～5%，分子量范围几百～2万个核苷酸，变化大（RT/PCR）。原核和真核生

3、物mRNA的结构不同。tRNA各种物种的tRNA均含有73～93个核苷酸，一端是CCA结合氨基酸部位，另一端为反密码子环。tRNA通晓mRNA的核苷酸语言和蛋白质的氨基酸语言（AARS），是蛋白质翻译的译员。RNA的生化特型真核生物　　　（80S,小40s大60s)原核生物(70S,小30s大50S）小亚基rRNA16S(有mRNA识别结合位点)18S(有mRNA识别结合位点)蛋白质21种33种大亚基rRNA23S、5S（识别、结合tRNA）28S、5S、5.8S(识别、结合tRNA)蛋白质34种49种rRNArR

4、NA与核糖体蛋白共同构成核糖体，后者是蛋白质合成的场所。核糖体的组成WhatistheGene?基因（gene）是核酸贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。该顺序可以产生或影响某种表型，可以由于突变生成等位基因变异体。基因组的基本结构基因组（genome）指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和，包括全套基因及间隔序列。人类基因组包含22条常染色体和XY两条性染色体上的全部遗传物质（核基因组）以及线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。原核基因组和真

5、核基因组真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一人类染色体单倍体DNA全长3×109bp，含3~4万个基因。大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。原核基因组ProkaryoteGenome基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。基因组中只有1个复制起点。基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为单拷贝。基本结构特点：启动子（promoter）、操纵基因（operator）、调控序列、结构基因（structuregene）、终止子（t

6、erminator）。基因序列是连续的，无内含子结构连续密码区mRNA→Protein基本结构：结构基因（structuralgene）指能转录成为mRNA、rRNA或tRNA的DNA顺序。结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，分割成几段，编码序列称为外显子(extron)，其间的序列称为内含子(intron),称为断裂基因（splitgene）。非编码区剪切编码区编码区mRNAProtein真核基因组EukaryoteGenomeintronexonexon有大量重复序列原核生物基因表达的调控原核生物基因表达

7、的调控方式最重要的特点是操纵子模式。主要通过及时调整酶系统基因表达以适应环境，获取营养。调控水平主调在转录水平，翻译水平次之。真核生物基因表达的调控真核生物基因调控远比原核生物复杂，绝大多数真核生物基因极少数与环境变化有直接或间接的关系，其调控最大特点是遗传程序调控。调控主要水平是转录水平。其次为转录后水平、DNA水平、翻译及翻译后水平等。1．目的基因的获取2．DNA体外重组3．重组DNA的转化与增殖4．阳性重组体的筛选探针、PCR、测序5．目的基因的表达表达产物的应用限制性内切酶载体分子杂交基因操作的基本内

8、容和程序基因操作的基本策略1.目的基因的获取1)基因库筛选、扩增:"Shotgun"限制性酶法，机械切割。2)逆转录法逆转录酶合成全长或近全长ds-cDNA．3)人工合成基因：小片段连接，PolymeraseChainReaction基因操作的基本内容和程序基因操作的基本策略2.DNA体外重组常用的工具酶（toolenzymes）限制性核酸内切酶（resri