基因操作及其医学应

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1、GENEMANIPUTATIONANDITSAPPLICATIONINMEDICALPRACTICE基因操作及其医学应用鲍朗教授基因操作的概念基因操作的基本策略定义：在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为DNA重组技术，主要程序是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传物质的新组合，然后转移到宿主细胞产生新的表型。WhatistheGene?基因（gene）是核酸链上贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。WhatistheGenome?基因组（genome）指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质

2、的总和，包括全套基因及间隔序列。人类基因组包含22条常染色体和XY两条性染色体（核基因组）以及线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。原核基因组和真核基因组真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一人类染色体单倍体DNA全长3×109bp，含3~4万个基因。大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。原核基因组ProkaryoteGenome基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。基因组中只有1个复制起点。基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为单拷贝。基本结构特点：启动子（promoter）、操纵基因（operato

3、r）、调控序列、结构基因（structuregene）、终止子（terminator）。基因序列是连续的，无内含子结构连续密码区mRNA→Protein基本结构：结构基因（structuralgene）指能转录成为mRNA、rRNA或tRNA的DNA顺序。结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，分割成几段，编码序列称为外显子(exon)，其间的序列称为内含子(intron),称为断裂基因（splitgene）。非编码区剪切编码区编码区mRNAProtein真核基因组EukaryoteGenomeintronexonexon有大量重复序列获取目的基因常常是基因操作的首要步骤。化学合成法基因文

4、库法（或cDNA文库法）PCR法获取目的基因较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针化学合成法构建不同的基因文库通过核酸杂交的筛选或通过抗原抗体反应的筛选基因文库法获取目的基因聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。是获取已知序列候选基因的主要方法。PCR法PCR技术的基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5’94℃55℃72℃基因重组基因操作的关键步骤和核心内容关系到研究的成败或质量包括：基因分离，基因组合，

5、基因转化，基因筛选分:切:限制性内切酶“分子手术刀”限制性核酸内切酶命名Smith和Nathame命名原则（1973）属名+种名+株名+流水号举例：流感噬血杆菌d株（Haemophilusinfluengaed）HindⅠHindⅡHindⅢ5’AAGCTT3’HindⅣ3’TTCGAA5’限制性核酸内切酶restrictionendonuclease在特异位点上切割DNA分子分三类，常用为Ⅱ类酶识别序列呈回文对称（palindromesequence）5’GAATTC3’5’GGATCC3’3’CTTAAG5’3’CCTAGG5’EcoRⅠ的识别序列5’-GAATTC-3’3’-C

6、TTAAG-5’HaeⅠ的识别序列5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’限制性核酸内切酶酶切单酶切用一种限制酶酶切目的基因和载体易发生自身连接双酶切用二种限制酶酶切目的基因和载体不易发生自身连接接:“分子针线”目的基因片段与载体的连接★粘末端法：碱性磷酸酶退火★平接法：T4噬菌体DNA连接★接头法：人工合成R.E识别顺序★聚尾法：分别加连polyA(T)或G是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的双链DNA分子，大小在1—200kb之间，能独立复制的最小遗传单位。质粒（plasmid）质粒的分类克隆载体(cloningvector,Puc18,19)都有松弛的复

7、制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。带有一些基本元件（ori,Ampr,Mcs等），用来克隆和扩增基因片段。表达载体(Expressionvector,PET30a,pMV361)除了有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。为了有效的转录，必需有强大的启动子(Trp,Lac)。重组DNA的转化与增殖制备CompetenceCell（氯化钙处理幼嫩E.coli,yeast,动物cell,