基因工程制药pa(I)

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1、高效表达目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞表达质粒的优化和设计在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。表达质粒的优化和设计表达质粒的优化和设计构建表达质

2、粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围。核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，表达质粒的优化和设计具体表现为：SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6倍。翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，mRNA翻译效率

3、较高。表达质粒的优化和设计核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA5’端的二级结构，研究表明mRNA5‘端形成的“茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA5’端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。表达质粒的优化和设计在必要的情况下，还可通过顶点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA5‘端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始

4、元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。表达质粒的优化和设计在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有：编码Arg的密码子AGA、AGG、CGA、CGG编码Pro的密码子CCC、CCU

5、、CCA编码Cys的密码子UGU、UGC编码Gly的密码子GGA、GGG编码Leu的密码子CUA、CUC编码IIe的密码子AUA编码Ser的密码子UCA、AUG、UCG、UCC编码Thr的密码子ACA由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。解决这一问题的办法：通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密码子。在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。共表达大肠杆

6、菌稀有密码子tRNA基因在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNAArg（AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核基因中经常出现。人尿激酶原ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA等基因中都含有较多的AGG和AGA密码子，在大肠杆菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达tRNAArg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能明显得到提高。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有密码子存在的

7、位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过实验才能得出。由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因mRNA和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因蛋白质水解酶的特点细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、

8、Tyr、Trp残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白质降解，稳定性较差。在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶活力往往能达到比较高的水平。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间，或分泌到培养基采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表