《发酵工业制药pa》PPT课件

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1、六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用主要应用：1.提高次级代谢产物的产量2.改进代谢产物的组分3.改进菌种的生理性能4.产生新的代谢产物㈠提高次级代谢产物的产量基因工程技术提高抗生素产量的主要手段增加限速酶的基因拷贝数增加正调节基因，去除负调节基因增加抗性基因的拷贝数六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用1.增加限速酶的基因拷贝数原理：ABCDE（代谢产物）EaEbEcEd限速酶Rate-limitingBottleneck例1：起始原料ACV三肽异青霉素N青霉素EaEbEcα-aminoadipicacidL-

2、cvstcincEa：ACV合成酶Ec：异青霉素N酰基水解酶L-valincEb：异青霉素N合成酶青霉素酰基转移酶六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响菌株原始菌株低产菌株Wis54-1255高产菌株AS-P-78IPNS的基因拷贝数1----9-14mRNA1----32-64青霉素产量100%导入带IPNS的基因片段140%六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加IPNS基因提高青霉素产量六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用例2.头孢菌素C的生

3、物合成的限速酶在头孢菌素C的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另一种产物-青霉素N。问题：积累中间产物-青霉素N原因：下一步反应为限速酶反应解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因结束：使头孢菌素C的产量提高25-50%，积累的青霉素N消失。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶基因提高头孢菌素C的产量六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶的其它例子-3：例3.十一烷基灵菌红素产生菌：天蓝色链霉菌S.colocolorA3(2)acetyl

4、CoA构建重组质粒（带甲氧基转移酶）Polyketidepathway转化到氧甲基转移酶缺陷变株转化菌株十一烷基灵菌红素产量提高5倍S-酰苷甲酰氨酸氧甲基转移酶六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶的其它例子-4：例4.泰洛星（Tylosin）产生菌：氟式链霉菌（S.fradiae）acetylCoA+malonyCoAPolyketidepathway构建重组质粒（带甲氧基转移酶）转化到氟式链霉素（S.fradiae）泰洛星（Tylosin）产量显著提高甲氧基转移酶大菌素（macrocin）Tylosin转

5、化菌株六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.增加正调节基因，去除负调节基因调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转录。将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水平的表达，提高了代谢产物的产量。反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节

6、基因基因效应菌株次级代谢物功能brpA正吸水链霉素Bioalaphos激活bar（Bialaphos抗性基因和6个bap（生物合成）基因的转录ty1G正弗式链霉菌泰洛星激活tylF（编码MOMT）和其它tyl生物合成基因的表达actII正天蓝色链霉菌放线紫红素能使act菌株放线紫红素的产量增加30~40倍mmy负天蓝色链霉菌次甲霉素该基因的插入失活导致次甲霉素过量生产strR正灰色链霉菌链霉素调节链霉素的生物合成调节基因在次级代谢产物合成中的作用六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用去除负调节基因时结构基因超量表达Me

7、thylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉菌携带的质粒SCPI编码的。在其生物合成结构基因的上游，存在一个负调节基因-mmy克隆到质粒上转化变青链霉菌转化子（次甲霉素高产表达）六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.增加抗性基因的拷贝数抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身的代谢产物所杀灭。其作用可通过三条途径实现：1.抗性基因产物（酶）将抗生素作用的底物加以修饰；2将抗生素的分子结构加以修饰，使其失活；3将抗生素分子排出细胞外。提高菌种耐受自身产生

8、抗生素的能力是取得高产的前提，此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量