《发酵工程制药》PPT课件

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1、第九节基因工程在发酵工程中的应用以天然产物为基础发展药物的方法获得新型结构和生物活性的抗生素变得越来越难一.自然分离合成步骤繁多、合成产率低下二.化学合成以微生物作为“细胞工厂”，通过对代谢途径的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。基因工程改造传统制药工业体现在四个方面1、抗生素生产：分离抗生素合成酶基因，提高产量、得到杂合抗生素；2、氨基酸生产：基因克隆的工程菌、细胞融合育种；3、维生素生产：构建制造维生素C的基因工程菌；4、疫苗生产：把抗原克隆到E.coli中大量生产疫苗。直接从自然界分离得到

2、的菌株为野生型菌株。菌种选育突变、体内重组、体外重组（基因工程）一、基因工程在抗生素生产中的应用往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产微生物基因工程育种这是一种自觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。获得特定的目标基因载体(质粒或病毒)目标基因片段质粒DNA片段内切酶切割细胞外重组重组DNA重组DNA进入受体细胞并扩增、表达具有目标基因表达功能的重组体利用遗传标记筛选转化(质粒)、转导或转染(病毒)（一）抗生素生物

3、合成基因的特点及其克隆的策略和方法1、抗生素生物合成基因群成员的结构特点在已知的微生物所产生的抗生素中，约2／3由放线菌产生，而其中的80％来源于链霉菌；链霉菌属中的链霉菌，有约500个种。2002年5月，BentleyS.D.等在英国Nature报道了链霉菌的模式种天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)菌株的基因组全序列研究结果：基因组全序8,667,507bp，GC含量72.12%，7825个基因，55个假基因，基因平均长度991bp，编码密度88.9%。⑴链霉菌

4、抗生素生物合成基因群成员的DNA组成GC含量高达70％以上；三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高。⑵抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个;阿克拉霉素每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后排列成基因簇(genecluster)，包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁并存在一种协同调节机制。抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素的伤害。

5、研究还发现，产抗菌株的抗性水平与该菌株自身的抗菌素产量水平呈正相关。阿克拉霉素Aclacinomycin目前用于治疗急性白血病(Leukemia)与淋巴瘤(Lymphomas)有良好疗效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomycesgalilaeus合成的聚酮类化合物，其合成酶的生物合成涉及13个基因，紧密成簇排列。返回⑶少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上如天蓝色链霉菌3(2)菌株中的次甲霉素A（MethylenomycinA）的生物合成基因位于SCP1质粒

6、上。抗生素生物合成基因群成员的结构特点⑴链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNA组成：GC含量高达70％以上、三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高；⑵抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个；⑶少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上。7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素的生物合成基因。这7个方法是：在标准宿主系统中克隆检测单基因产物阻断变株法突变克隆法直接克隆法克隆抗生素抗性基因法寡核苷酸探针法同源基

7、因杂交法2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑴在标准宿主系统中克隆检测单基因产物“鸟枪法”克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。对氨基苯甲酸合成酶(PABA)基因(pab)是灰色链霉菌的杀念珠菌素生物合成酶基因簇的一个成员；以pab＋(野生型)灰色链霉菌菌株为供体，提取总DNA、BamHⅠ切割、与质粒pIJ41重组、转化pab－(PABA营养缺陷型)菌株，选择pab＋(PABA营养原养型)菌株；过量表达PABA的灰色链霉菌具有磺胺抗性，以其为供体、鸟枪法转化变青链霉菌66，在转化子中筛选PABA原养

8、型或磺胺抗性菌株；二者筛选出来的阳性转化子都携带一个45kb的BamHⅠ片段，意味着pab基因与磺胺抗性基因可能是同一个基因。鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑵阻断变株法检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的DNA片段的性质。放线紫红