图位克隆的基本原理和方法

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1、图位克隆的基本原理和方法何宗顺2011.12.7图位克隆的基本原理其基本的原理是：功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。图位克隆的步骤：PrimarymappingFinemappingCandidategeneComplementationtestFunctionalanalysisPrimarymapp

2、ingTraitmethodMappingpopulationQualitativetraitsbulkedsegregmentanalysisF2、BC1Quantitativetraitswhole-genomeQTLscreenRIL、DH、NILprimarymappingmethodandMappingpopulation作图群体将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离），将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。R/Rr/rR/RR/rF2×R/rr/rF1P

3、1纯合突变体P2ZS97primarymappingmethodBulkedSegregmentAnalysis：群组分离分析法。原理是将分离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY1(M

4、)HY2(W)HY2(M)HY3(W)HY3(M)HY5(W)HY5(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测：即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。同时我们可

5、以用这个小群体进行一个初步的基因定位。Finemapping一.表型观察二.筛选交换单株三.开发新的分子标记R/Rr/rR/RR/rF2×R/rr/rF1P1纯合突变体P2ZS97正常表型突变表型ZH11：“A”ZS97：“B”交换有两种带型：H和B单株12345678910M1M2M3M4M5HAABHAAAABHAABAAAAAAAAAAAAAAAAAHAAABHHAAAHHAABBHBA基因和表型相对应！开发新的标记：新的SSR标记：http://redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/ssrsc

6、an.php，运行SSRScan就会得到该段序列的简单重复序列。InDel/Caps标记：将要开发标记的日本晴区段序列与93-11做一个blast，选取插入或者缺失比较大的位点设计引物。SNPS标记:可以通过测序找到在ZH11/ZS97间存在单碱基差异的位点，或者找谢老师咨询。Candidategene将最后精细定位区段在http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/中输入定位区间的物理位置，即可显示出候选基因。精细定位扩大群体，进行精细定位找到候选基因后可对候选基

7、因进行分析以排除非目标基因，可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话就是构建互补载体做一个互补验证。Complementationtest