图位克隆原理ppt课件.ppt

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1、图位克隆原理简要说明1在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是Landsbergerecta(Ler)Columbia(Col)Wassilewskija(Ws)其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。2MarkerSSLPsCAPsdCAPsInDelSNP多态性3SSLP=simplesequencelengthpolymorphisms简单序列长度多态性又称SSR=simplesequencerepeats比较产物长度4CAPs=cleavedamplifiedpolymorphicsequences酶切扩增多态性利用酶切位点5Marker:MIG5

2、-BCLHC6dCAPs=derivedCAPS设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点7其它标记InDel=insertion-deletion插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，这就是InDel标记。部分SSLP就是由InDel转化而来密度：每6.6kb存在一个8SNP=singlenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态

3、性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。(后面两种情况的多态性一般归为InDel）密度：每3.3kb存在一个9SSLPs10粗定位引物（更新）11粗定位引物（混合）121314F1父本染色体母本染色体15F1假设：Aa突变位点BbMarker突变为隐性突变16F1配子长根长根长根长根长根短根短根长根长根短根17F2短根个体Col单带Ler单带ColLer双带因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突变

4、位点不可能存在交换，交换率=0其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交换次数18wildtypemutant杂交ColLerF1plant图中的两个亲本不但在A/a位点有差异，在其他位点也存在大量的遗传差异，可以利用这些差异设计分子标记，对染色体的具体区段进行标定。在该例子中，该染色体上总共确定了5个分子标记，标定了5个不同区段。假设：Aa突变位点有5个Marker19只有左侧三种植株会选入定位群体自交F2plants假设：只存在单交换20分子标记M5与突变位点的遗传距离：10/1006/1004/100(20/(100×2))×100%=10cMM5处

5、发生交换的植株包括三种情况假设：统计100个个体21分子标记M4与突变位点的遗传距离：6/1004/100(10/(100×2))×100%=5cM22分子标记M3与突变位点的遗传距离：4/100(4/(100×2))×100%=2cM23M4m4如何分辨来自于两个亲本的染色体？目前最常用的分子标记是利用两个亲本中同一染色体区段的长度差异来设计的，如左图亲本Ler的M4处染色体区段长于亲本Col中m4染色体区段，在该差异位点两侧设计引物经PCR扩增后得到的PCR产物就会有不同长度，电泳后M4泳动速度慢，m4泳动速度快，因此通过电泳就可以分辨来自于两个亲本

6、的染色体区段24包含来自于两个亲本的染色体片段包含来自于Col两条染色体区段包含来自于Ler两条染色体区段注意后两种情况反映的是来自于两个配子的染色体区段的情况25Col*********1、4、8、10、11、13、15、18、19共9个样品，只包含来自于亲本Col的染色体区段，没有发生交换26Ler***5、6、14共3个样品，只包含来自于亲本Ler的染色体区段，也就是发生了两次交换27Col*******2、3、7、9、12、16、17共7个样品，包含1个来自于亲本Col的染色体区段以及1条来自于亲本Ler的染色体区段，即发生了一次交换Ler28突

7、变位点与分子标记M的遗传距离：交换次数配子总数×100%3×2+719×2×100%≈34cM=293031SSLPs32SSLPs3340.48%20.00%4.76%4.76%12.5%12.5%36%34步骤总结筛选F2代短根移栽提基因组各对引物PCR统计计算Rf缩小范围寻找新Marker扩大群体(筛选重组子)3周左右35在突变位点附近区域内绝大部分的样品跑样结果都应该为只有非重组的Col条带，即记录Rf为0，只有少数的样品存在交换，Rf记为1。图中的6、12号样品即为重组子什么是重组子36在筛选出6、12号两个重组子以后，假设在目标区域内寻找到新

8、的标记引物，就不需要把所有的个体跑样，只需要跑重组子个体例：筛选重组子的目的Rf