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1、流动相对色谱峰形及保留值的影响pH应用反相高效液相色谱进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的pH值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性。例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、甲酸、硫酸)，就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。对于弱碱性样品，向流动相中加入三乙胺，也可达到相同的效果。方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相，pH值的较大变化往往会对分析结果产生很大影响，因此流动相pH值的调节是分析过程中至关重要
2、的一个环节。将常用药物按它们对流动相pH值变化的保留值函数特征分成碱性、酸性和中性三类,有利于从宏观上把握药物的色谱行为趋势,可以有预见性地规划分离条件的选择,减少不必要的实验条件和实验次数,对内标物的选择及分离度的改善和保留值的增减趋势均可作出事先的判断,这对在药物分析实践中有指导意义。式中k′p、k′p+1是pH值分别为p、p+1时的容量因子,n为pH2-5时的pH值,Sp、Spn为流动相pH值增加±1时药物容量因子的响应系数和平均响应系数。定义:Spn>0.1,物质为碱性,保留值随pH值增加而增加;Spn<-0.1,物质为酸性
3、,保留值随pH值增加而减少;-0.1≤Spn≤0.1,物质保留值几乎不受流动相pH值变化的影响,被定义为中性。化学结构是药物理化特性、色谱特征的物质基础,不同结构的药物表现出不同的色谱行为。碱性药物均含有未参予共扼体系的氮原子,酸性药物含羧基或磺酸基团,中性药物不含酸碱基团,如甾体类和酰胺类酸性烟酸阿魏酸卡托普利蔡普生布洛芬对氨基水杨酸甘草酸水杨酸碱性普罗帕酮法莫替丁阿替洛尔利多卡因苯丙哌林环丙沙星维拉帕米氯丙嗪中性茶碱维生素c非那西丁卡马西平硝苯地平地西泮阿昔洛维有的药物在结构上同时含有酸性、碱性基团,却表现出不同色谱行为。如环丙
4、氟呱酸和氨甲苯酸呈碱性,丙谷胺为酸性,而氟呱酸却类似中性。磺胺类药物多为中性或呈弱碱性。一般来说,碱性药物的保留值对pH值的敏感性差异较大,保留值大的药物对pH值的敏感性较大,碱性药物对pH值敏感性在pH>4时显著增加,如酮康哇和益康哇。所以当分离碱性或酸性药物采用的流动相pH值在4左右时,要特别给予注意,以免影响分离度和峰序的改变,如环丙沙星与氟哌啶,地卡因与普罗帕酮等在一之间发生峰序倒置。如果水未冷却到室温就调节流动相pH值，会造成流动相pH值的较大偏离，从而导致整个色谱分析实验的偏差甚至失败。pH>8,硅胶基质的溶解pH<2,
5、键合相基团脱落调节水相离子强度在反相高效液相色谱过程中,流动相的离子强度可显著影响可解离的化合物的色谱峰形。过载（overloading），峰形接近直角三角形。随着进样量的增加,色谱区带中高浓度的前半部的保留时间减少,但色谱区带均在同一时刻结束,色谱峰的拖尾因子及峰宽均显著增加,同时被测物与有关物质间的分离也随之变差。选择合适的缓冲盐并适当地增加流动相的离子强度即可显著改善色谱峰形,色谱峰的拖尾因子及峰宽均随之降低,同时被测物与有关物质间也更加易于分离。overloading以硅胶为基质的反相键合相填料的表面实际上是不均匀的,固定相
6、中不可避免地含有少量高能量位点(sites),这些高能量位点易被可解离的(甚至中性的)化合物所过载。解离的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及较难渗透进入疏水性的固定相中也是可能的原因，采用反相高效液相分离可解离的(尤其是碱性的)化合物时色谱柱易于过载,甚至低达10ng的碱性化合物也可使常规色谱柱的表观柱效明显降低;减少进样量则可改善色谱峰形并使表观柱效显著增加;过载效应可随着流动相的离子强度的增加而逐渐减弱。分离可解离的化合物时,流动相中添加缓冲盐并非仅仅用于稳定流动相的pH值,缓冲盐、甚至简单的中性盐（如氯化钠）的反离子还可与离
7、子化的被测物通过相互间的缔合作用形成疏水性较强的中性离子对复合物;在低离子强度的缓冲液中,吸附在固定相表面的离子化的被测物分子的极性基团相互之间存在静电排斥效应,这使得色谱柱的饱和容量显著降低;随着缓冲液浓度(离子强度)的增加,中性离子对复合物的浓度相应增加,固定相表面离子化的吸附物之间的相互排斥作用随之减弱,导致色谱柱的饱和容量、尤其是填料上的低能量位点的饱和容量以及平衡常数增加;盐一类的流动相添加剂可破坏离子化的被测物在流动相中的溶剂化-去溶剂化平衡,产生所谓的促溶效应(chaotropiceffect),被测物与盐相互作用,离
8、子化的被测物相互间的排斥作用减弱,从而显著地影响被测物在固定相上的吸附行为;在制备色谱系统中或被测物浓度较高时,流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。色谱柱的饱和容量可随缓冲盐的单价阳离子(如Na+、NH4+、K+、Cs
