植物组织培养的基本技术与设施

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1、第一节植物组织培养的操作方法概述一、外植体的选择二、外植体的灭菌三、外植体的接种和培养四、外植体的成苗途径五、污染的原因及其预防措施六、外植体的褐变及其防止措施七、培养物的玻璃化现象及其防止措施八、试管苗的驯化与移栽外植体（Explants）：指植物离体培养的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。一、外植体的选择外植体的选择依据优良的种质健壮的植株大小适宜的外植体适宜的发育时期适宜的部位适宜生理状态和发育年龄的器官细胞培养材料的选择（二）外植体灭菌的一般步骤二、外植体的灭菌（一）常用灭菌剂的使用及其效果（三）各种外植体的灭菌方法（一）常用消毒剂消毒剂使用浓度（％）去除的难

2、易消毒时间（分）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗菌素硝酸银9～102饱和溶液1～210～120.1～170～754～5（mg/L）1易易易易最易较难易中较难5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好较好好自:曹孜义（二）外植体灭菌的一般步骤3.将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动2～3次。4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动

3、数次，将水倒掉，重复3～4次。1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。1、茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒后，用无菌水冲洗3次后方可接种。2、果实及种子的消

4、毒用自来水冲洗10～20分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠溶液浸10min后，用无菌水冲洗2～3次。种子要先用10%次氯酸钠浸泡20～30min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。（三）几种外植体的灭菌方法70％酒精擦洗花蕾，或浸泡数秒钟饱和漂白粉上清液：浸泡10分钟；或次氯酸钠液2％～5％：8～10分钟无菌水冲洗几次后，吸去水分，剥取花药或胚珠接种。3、花药的消毒预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤

5、及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用0.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸10～15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。4、根及地下部器官的消毒三、外植体的接种和培养（一）无菌操作（二）外植体的培养植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。在操作过程中引起的污染来源：主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。（一）无菌操作污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子每次接种前半小时地面：用70％酒精喷雾使空气的灰尘沉降。紫外线灯照射20分钟。工作台面要用新洁

6、尔灭或酒精擦洗。1、接种室的消毒入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。2、工作人员要求切取和接种较大的材料肉眼观察即可操作分离，较小的材料需在双筒解剖镜下操作。分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压使材料损伤而失败。接种时要防止交叉污染的发生3、材料的切取酒精擦拭手外植体消毒浸泡5mi

7、n器械消毒酒精灯灼烧4、接种的具体操作旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞1、培养条件：温度：常保持在23±2℃，夜温低1—2℃光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照）光照强度：1000—3000lx，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导）相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度（二）外植体培养接种后3～7天内，主要是检查其污染情况。增殖、继