《酶学基础》PPT课件(I)

《《酶学基础》PPT课件(I)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第二章分子克隆的工具酶工具酶：进行DNA操作经常要用到的“工具”——酶工具酶（四大类）核酸酶nucleases脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease核糖核酸酶ribonuclease外切酶exonuclease单链外切酶双链外切酶内切酶endomuclease限制性内切酶非限制性内切酶连接酶ligase聚合酶polymerase修饰酶modificationenzyme有人也简单的将它分为两类：限制酶和其他酶类（连接酶，聚合酶，核酸酶，激酶，磷酸酶）。上述酶的分类不是绝对的，因有的酶兼有数种功

2、能，如：聚合酶有外切酶功能；内切酶有甲基化酶功能等。四大酶类大都是从细菌和phage中纯化出来的，它们原本参与细菌/phage自身DNA的复制、转录、降解外源入侵DNA分子、修复突变、重组等一系列生命活动，被纯化后用来在人工条件下进行体内类似的反应。第一节限制性内切酶（restrictionenzyme）一、限制性内切酶的发现1952年Luria、Human在T偶数噬菌体，1953年Weigle、Bertani在λ噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导

3、致限制性核酸内切酶的发现。限制性内切酶：指能识别特定的DNA序列，在一定的条件下，可在识别位置上或附近对DNA进行切割的酶（简称限制酶）。噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用(host—co

4、ntrolledrestriction)。用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解；然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)DNA的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此，乃是通过称为宿主控制的修饰作用(host-controlledmodification)。限制(restriction)作用是指细菌的限

5、制性核酸酶对DNA的分解作用，一般是指对外源DNA侵入的限制。修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restriction—modificationsystem,R-Msystem)。该系统中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来

6、，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。1968年，Meselson从E．coliK株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从E．coliB株中分离到限制酶EcoB。遗憾的是，由于EcoK和EcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割DNA，这个酶后来命名为HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识别序列和切割位点特异

7、性很强，对于分离特定的DNA片段就具有特别的意义。二.限制性内切酶的命名与种类按照国际命名法，限制性核酸内切酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith和Nathans对内切酶的命名提出建议；1980年，Roberts对限制性酶的命名进行分类和系统化。限制酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的一个首字母，再加上序号，A、第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母B、第二、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2个字

8、母C、第四个字母大写代表不同的变种/品系小写代表不同的菌株和型D、最后罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶属名种名株名HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶注意限制性内切酶的正确写法：1、前3个字母一定斜体2、字母与罗马数字间空格如：EcoRIPstI特性I型II型III型限制酶活性＋＋＋甲基化酶活性＋－＋DNA的识别＋＋＋切割特异性随机，切割