多肽修饰的纳米金加速油 水界面酶促反应

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第9期2010年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1333～1336DOI:10．3724/SP．J．1096．2010．01333多肽修饰的纳米金加速油-水界面酶促反应1，2*1，2，3杨小超莫志宏123(重庆大学生物工程学院，新型微纳器件与系统技术国家重点学科实验室，化学化工学院，重庆400044)摘要用固相合成法制备阳离子氨基酸组成的多肽，再将其连接到巯基化合物上，用于纳米金表面配体交换，制备阳离子多肽修饰的纳米金，并研究了这种纳米粒子

2、对油-水(O/W)乳液界面酶促反应速度的影响。结果发现，将含有荧光底物的乳滴同酶直接混合时，45min内溶液中未检测到荧光信号变化，但向该溶液中加入纳米粒子后溶液中荧光信号立即增强。出现该现象的主要原因是，当乳液界面酶促反应体系中含有纳米粒子时，纳米粒子表面的阳离子多肽同时吸附带负电荷的酶和乳液，迅速屏蔽酶与乳液之间的电荷排斥，使酶与乳液中的底物能有效接触，加速酶促反应进行;通过选用不同的油相制备乳液，调控纳米粒子与乳液之间的氢键作用，还可使酶促反应速度进一步提高。关键词纳米金;酶促反应;乳液;界面1引言纳米金具有抗氧化性强、生物

3、相容性好、制备方法简单等优点，它是一种研究最广泛的纳米粒［1，2］子。金和巯基之间可以形成稳定的共价键，用含巯基的化合物修饰纳米金表面，可以得到稳定性很［3］［4］好的纳米粒子。近年来，用两相合成法制备约2nm的纳米金，并用配体交换法对其表面进行单分子层修饰，制备功能性纳米金的方法备受关注，其原因主要是这种纳米粒子的粒度与许多生物大分子相近，并且具有相当大的比表面积，进行适当的修饰后能与生物分子发生强烈的吸附作用，是研究纳米粒子和生物分子相互作用的理想材料。目前，这类单分子层修饰的小粒度纳米金已经应用于蛋白质-蛋白［5］［6］［7

4、］［8］质吸附的阻断、α-螺旋识别、变性蛋白质构象恢复及生物转运等领域的研究。酶是一类具有催化功能的生物大分子。酶促反应具有高度的化学专一性、立体选择性和位置选择［9～11］性。酶促反应在工业生产中，特别是食品、药品和环境化学领域有重要用途。由于工业生产中许多酶促反应的底物为脂溶性物质，因此这些酶促反应需要在油-水界面进行，其中脂肪酶是一种在油-水界面执行酶促反应使用最多的酶，它可以催化脂类水解、脂类合成和手性化合物拆分等化学反应，该酶［12，13］在油-水界面具有最大活性。脂肪酶为水溶性生物分子，要使该酶均匀分散于油-水界面执行

5、催化［14］功能，需对其进行化学修饰，常用的方法为在酶表面修饰聚合物，其中以聚乙二醇研究最多，但对酶进行共价修饰容易造成酶的构象发生改变，从而影响酶的活性。本研究制备了一种阳离子多肽巯基配体，通过配体交换法将其用于粒度约为2nm的纳米金的表面单分子层修饰，得到了阳离子多肽修饰的纳米金，并研究了这种纳米粒子对油-水(O/W)乳液界面酶促反应的影响。2实验部分2．1仪器与试剂基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，BrukerDaltonics公司);100CX透射电子显微镜(JEOL);SpectraMaxM5酶标仪(

6、Spectramax);Zeta电位仪(MalvernZetasizerNanoZS)。脂肪酶(Candidaantarctica)及其底物4-甲基伞形酮(Sigma-Aldrich公司);三苯基保护的巯基化合物Trit-S-C11-TEG-COOH，按文献［8］的方法制备，其结构如图1所示。戊硫醇保护的粒径约为2nm的［3］纳米金采用两相合成法制备。多肽固相合成所需试剂包括哌啶、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二2009-12-18收稿;2010-03-02接受本文系国际科技合作项目(No．20072664)资助*E-m

7、ail:zhihmo@cqu．edu．cn1334分析化学第38卷异丙基乙胺(DIPEA)、苯酚、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIPS)、N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)等，均购自AdvancedChemTech公司;其它试剂均为分析纯;实验用水为超纯水(＞16MΩ·cm)。2．2多肽巯基配体的合成［15］多肽以标准的Fmoc固相合成法制备，其序列如图1所示。组氨酸、精氨酸和赖氨酸的侧链保护基团分别为Trt、Pmc和Boc。多肽合成时树脂/氨基酸/HOBt/HTBU/DIPEA的摩尔比为1∶5∶5∶5∶10。多肽合成完毕

8、后通过氨基和羧基的缩合将其与Trit-S-C11-TEG-COOH联接在一起，形成多肽巯基配体，其操作步骤如图解1所示。Trit-S-C11-TEG-COOH与多肽缩合时，树脂/Trit-S-C11-TEG-COOH/DIC/HOBt的摩尔比为1∶