谷胱甘肽含量测定

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1、植物生理学模块实验指导李玲主编科学出版社还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。【实验原理】谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm

2、处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。【器材与试剂】1.实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计2.实验试剂50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/LNa2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。再称取186mgNa2-EDTA·2H2O，加入到100ml50g/L三氯乙酸溶液中溶解。0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。4mmol/L二硫代硝基苯

3、甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）溶液：称取15.8mgDTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。1.实验材料同抗坏血酸。【实验步骤】1.标准曲线制作取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。项目试管号

4、012345100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.200.1mol/LpH7.7磷酸缓冲液/ml1.01.01.01.01.01.04mmol/LDTNB试剂/ml0.50.50.50.50.50.5相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol0204060801002.提取取材后，称取2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/LNa2-EDTA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、12000g离心20min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。3.测定取

5、1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml4mmol/LDTNB荣毅仁，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）。向一支试管加入0.5ml4mmol/LDTNB溶液，另一支试管中加入0.5ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8），将两支试管置于25℃保温10min。按照制作标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412nm处的吸光度，分别记作ODs和ODc。重复3次。【计算结果】n×VVs×m显色反

6、应后，分别记录样品管混合液的吸光度（ODs）和空白对照管反应混合液的吸光度（ODc）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）=式中，n为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）；V为样品提取液总体积（ml）；Vs为吸取样品液体积（ml）；m为样品质量（g）。【注意事项】1.在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR）

7、作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。3.建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。