实验六-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定

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1、酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定蔗糖酶活性及比活性测定原理+蔗糖酶蔗糖酶的酶活单位：在40℃水浴反应10min，测定吸光值A540，增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的纯度越高。试剂（一）蔗糖酶的粗提及活性测定（1）冰冻无水乙醇：1瓶/班（2）0.01mol/LpH6.0PBSbuffer，2000ml（全班共用）（3）0.01mol/L蔗糖,用0.01mol/LpH6.0PBSbuffer配制，200ml（大组共用）（4）2mol/LNaOH，1000ml（全班共用）（5）3,5-二

2、硝基水扬酸(DNS)试剂：可配300ml（全班共用）19.2克酒石酸钾钠溶于50ml水中（电炉加热溶解，不用沸腾），把.0.63克3,5-二硝基水杨酸(DNS)和26.2ml2mol/LNaOH加到酒石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到50-60℃，再加0.5克苯酚和0.5克亚硫酸钠．搅拌使溶解．冷却后加水定容至100ml，过滤，贮于棕色瓶中。实验方法（一）粗提取酵母蔗糖酶（1）量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少量石英砂）至粉状，再加入10-12ml的0.01mol/LPBS（pH6.0），搅拌混合。置于小烧杯中。（2）置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。（二）热提取酵母蔗糖

3、酶（3）解冻，然后置于离心管中，离心，转速11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。（4）将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。（三）乙醇提取酵母蔗糖酶（1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50％），并轻轻的搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装入离心管中，转速3000r/m

4、in条件下离心5min，离心后弃上清液，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇残液。留沉淀。（2）将沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS（pH6.0）搅拌溶解30min，溶液为浑浊液，再离心，转速10000r/min条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分别测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。表1酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定试剂对照管粗提A1粗提A2热提B1热提B2醇提C1醇提C20.1mol/L蔗糖（ml）0.20.20.20.20.20.20.22mol/LNaOH（ml）0.100000040℃恒温水浴准确保温10min各组酶液（ml）0.10.10.10.10.10.

5、10.01mol/LpH6.0PBS（ml）0.140℃恒温水浴中准确反应10min2mol/LNaOH（ml）0.10.10.10.10.10.1DNS（ml）0.50.50.50.50.50.50.5100℃沸水浴准确加热5min，立即冷却蒸馏水（ml）5555555摇匀，以对照管作空白A5400酶活（U）0酶比活力（U/mg）0酶比活力平均值（U/mg）0注意：对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配蔗糖溶液。实验结果分析思考题：（1）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。（2）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。