实验三盐析β-d甘露聚糖酶活力测定

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1、一.实验目的1、掌握P-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间P糖苷键的机制和理论。。2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中P-D甘露聚糖活力的操作方法。二.基本原理水解含B—1，4甘露糖苷键的甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等）的内切水解酶，属于半纤维素酶类。B—甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的卄露低聚糖在动物肠道中起着重耍的调节作用。三、实验试剂和器材721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。PH5.6的醋酸缓冲液四、实验步骤1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在8

2、000rpm，离心lOmin。收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。（透析俊处理：剪成15cm长度，沸水浴中煮lOmin,捞起、扯幵，在一端1cm处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。处理过程屮需戴手套！）2、酶液倒入透析袋后，另一端lcm处也用细绳（应用长一点的！）扎紧U,浸于4〜5°C的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间1.Oh,并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4〜5°C的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。注：1、上端门切不可浸于水中，以免水进入袋屮胀破透析袋！2、透析同

3、吋可准备2支50ml的比色管，各加0.25g魔芋精粉，加25mlpH5.6的醋酸缓冲液溶解。操作顺序：先量取25mlpH5.6的醋酸缓冲液加入比色管，在55°C水浴预热，再分次、少量将0.25g魔芋精粉加入，待先加的溶解后再加剩下的！可用竹筷帮助溶解，为免捅破比色管底，切忌用玻棒！溶解完毕，将2支溶有魔芋精粉的50ml比色管始终置于55°C水浴屮预热待酶解。3、将透析好的酶液透析袋置于玻璃漏斗上，剪去上端口一部分，但不要使酶液流出！4、2支溶有魔芋精粉的50ml比色管1支加透析好的酶液2ml;另1支加灭活的透析酶液2ml（用做对照），将2管同时置于55°

4、C水浴下反应10min,取出，放入4〜5°C的蒸馏水中（250ml烧杯）冷却，再进行下面操作：（酶液灭活：取5毫升透析酶液置于10ml的比色管，沸水浴15mine）1、事先准备2支25ml的比色管，1支加4.5mlDNS试剂，立即加上述1.5ml酶解反应液；2、另1支加4.5mlDNS试剂，立即加1.5ml对照管的酶解反应液（即用火活酶水解的魔芋精粉管）；3、2管同时沸水浴5min后，冷却，定容至10ml,于530™下测定光吸收值。在本实验条件下，定义每min产生1冲还原糖的酶量为一个单位（u）。五、实验结果：计算3-D甘露聚糖酶活力酶活力（u/g湿基）

5、）=BxiOxV^xn2xL527B-样品所测吸光度值在标准曲线上的甘露糖，Ughnl'10-测吸光度时比色管的定容体积，m/;-溶解沉淀的体积，（V测量+2ml+5mD2-水解魔芋精粉消耗的酶液体积，m/;n-DMS反应显色液稀释倍数4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量，g（湿基）；甘露糖标准曲线0CSO251501O20406080iOO——1-20v=0.015X-0.139R2=0.965♦OD530—线性（OD530）标准甘靈糖浓度实验所得OD53O=1.028，此时卄露糖浓度为7.58ug/ml，代入公式计算P-D甘露聚糖酶活力为：酶活力=7.

6、58X10X20X1/2X1.5/27X1/4=3414（u/g湿基）七、思考题1、透析原理及其作用？透析是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开达到纯化与浓缩的效果的一种分离纯化技术。2、一般所选用透析液的性质如何？在搅拌下，样品液与透析液之比多少较好？在静止状态下过夜进行，样品液与透析液之比多少较好？选用的透析液一般是低离子强度的中性缓冲液，对含奋辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。在搅拌下进行时，样品液与透析液体积之比以1:10较好；若透析在静止状态下过夜进行，样品液与透析液体积之比应扩大到

7、1:20以上。