基因工程课件第6-9章

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1、第六章基因的转移技术第一节基因的导入方法所谓基因的转移技术就是将外源目的基因或DNA片段引人受体生物或细胞并检查其在转化细胞中表达结果的一种技术。一．基因导入方法1．细胞融合<10-62．微细胞介导的基因转移小于或等于10-63．染色体介导的基因转移<10-6利用中期染色体DNA进行转移4．脂质体介导的基因转移约2×10-4先用脂质体包装DNA，然后与细菌，植物原生质体融合5．磷酸钙沉淀介导基因转移10-3—10-76．原生质体融合术约0.1—0.3%溶菌酶处理细菌，再与动物细胞，植物原生质体融合7．显微注射法约1—10%

2、直接注射入细胞质或细胞核内显微注射法—利用显微操纵器，将DNA直接注射到细胞核中穿刺法—利用注射显微镜将微注射针固定，然后穿刺将DNA注入细胞核内8．电脉冲介导的基因转移10-4利用电脉冲改变生物膜透性，DNA可直接进入各种细胞9．重组RNA病毒感染约10—100%适用于动植物细胞10．重组DNA病毒感染约100%适用于各种细胞11．直接转化法包括：完整细胞或原生质体与DNA直接接触，DNA进入细胞内，这种方法适用于细菌，酵母菌，真菌和植物细胞。12．接合转移法适用于细菌之间和细菌与植物细胞之间，这种DNA转移是借助于某些

3、质粒上的转移基因产物13．超声波法现已用于植物细胞，可能还可用于其它生物14.基因枪法二．转移方法的选择选择方法的依据：1．转化频率取决于以下几个因素：1)外源DNA能否易于进入宿主细胞；2)重组DNA分子能否自主复制3)标记基因表达效率2.检测转化体的方法：是否具有选择压力3.生物材料的种类：细胞大小，有无细胞壁，除去细胞壁后的原生质体能否易于再生4.已有实验条件：仪器，载体种类等第二节转化体的检测1.药物抗性检测如用于细菌,真菌,植物和动物细胞的各种抗生素抗性基因:Ampr,Kanr,Hygr,G418r,Tcr等2.

4、遗传互补检测如用于酵母菌的各种氨基酸,核苷酸合成酶基因:LEU2,TRP1,TRP3,URA3等3.表型选择如用于细菌,植物和动物的LacZ,GUS等基因;用于细菌的噬菌斑4.凝胶电泳对于自主复制型载体,可从转化子中提取质粒DNA,然后经过电泳法进一步证实5.Southern杂交对于整合型载体,则应该利用DNA杂交法证实第七章基因表达第一节研究基因表达的方法研究基因表达应从以下几个方面考虑：1）转录：起始，延长和终止。基因转录的调控主要是起始阶段2）转录后修饰：hnRNA的加帽，加尾，拼接3）翻译：起始，延长和终止。调控亦

5、是在起始阶段4）翻译后修饰：蛋白质的糖基化，蛋白质水解反应，蛋白质的分泌等。一．转录系统1.体外转录系统1）分离RNA聚合酶，然后在体外进行待测DNA的转录反应2）利用全细胞抽提液，加入外源DNA，目前使用最广泛的抽提液来自海拉细胞和KB细胞3）利用具有SP6,T3和T7启动子的载体转录插入的外源DNA2.体内转录系统先分离细胞核，再进行转录反应二．翻译系统体外翻译系统（Invitrotranslationsystem）又称之为体外蛋白质合成系统(invitroproteinsynthesissystem)，是一种细胞裂解

6、物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDS—PAGE后可检测出翻译活性。常用翻译系统有以下几种：1.兔网织细胞裂解物(reticylocytelysatesystem)由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物注射苯肼后引起贫血产生的,向该系统加入血红素基和能量物质，裂解物中的内源mRNA可被翻译成球蛋白，其合成速度与用完整细胞的合成速度接近。2.小麦胚抽提物(wheatgermextract)该系统不具内源mRNA，属外源mRNA依赖型，利用Sephadex-G50可

7、减少该系统中的内源氨基酸，因而可大大增加翻译产物的高比活性。由于该系统存在着核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻译很大的mRNA，该系统仅为前一系统活性的1/10。3.其它系统：鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。4.两栖动物卵母细胞:翻译效率高，翻译产物稳定，灵敏度高（10ngmRNA），也可作为转录—翻译系统。微球菌核酸酶可除去内源mRNA，同时也不会对系统中的tRNA和rRNA损伤过大。由于该核酸酶的活性依赖于Ca2+，当除去内源mRNA后，可用EGTA除去Ca2+，此系统仍可保持70%的活性。因该系统无内源核酸

8、酶和蛋白酶，可用于大分子mRNA的翻译。三．转录—翻译系统1.原核生物系统1)体内基因表达系统i.UV照射宿主系统(U.V.—irradiatedhostsystem)E.coli经大量紫外线照射后，宿主细胞合成大大减少，然后感染携带外源基因的重组λ分子，并同时加入带标记氨基酸。新合成的蛋白质用SDS—