基因工程基本原理简介

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1、第十章基因工程基本原理简介本章的重点内容：1.什么是基因工程？2.获得目的基因的方法有哪些？3.如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？4.基因工程中的最新技术。第一节基因工程原理简介一、基因工程的定义本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因/DNA片段的结构与功能，或获得该基因的

2、表达产物。这一过程就是基因工程。广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得表达载体构建基因的导入表达的鉴定核酸鉴定：PCR;SouthernandNorthernblot.蛋白鉴定：SDS-PAGE;HPLC;Westernblot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核:包涵体,分泌型真核:文库合成PCR基因组文库cDNA文库细菌：氯化钙；电穿孔;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V;动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V；载体质粒(plasmi

3、d)粘粒(cosmid)λ噬菌体(λ)第二节基因工程的基本步骤和方法第三节基因工程中的通用技术一、核酸的提取纯化与定量包括RNA、DNA及plasmidDNA的提取纯化技术二、核酸电泳技术1.琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE500200010007501002001DL2000marker2BamH1和EcoRI双切3BamH1单切4HindⅢ单切5重组质粒pVAX1/ABPS112345三、核酸探针（probe）1.原理；2.标记物；3.种类；4.应用Dotblot、Southernblot：DN

4、A、Northernblot：RNA四、Westernblot:Protein一、获得目的基因的方法基因文库（cDNA文库和基因组文库），化学合成，PCR等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。第四节基因工程中的常用技术家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究CloningandinitialapplicationoffunctionalpromoterofMuscadomesticayolkpro

5、teingene启动子克隆一般思路启动子区杂交增强子调控启动子核心启动子基因3’5’转录起始点探针+50-40ATG-4000-500功能分析克隆启动子实验一、家蝇部分基因组文库的构建1材料与方法1.1家蝇基因组DNA的提取2.1基因组DNA的部分酶切3.1EMBL3载体臂的制备4.1连接与包装5.1基因组文库鉴定BclI随机酶切左臂基因组DNA右臂leftarm（20kb）centralstuff14kbrightarm9kbEcoRIBamHISalIBamHＩSalIEcoRIＥＭＢＬ３基因组D

6、NABamHI+CIPBclIBclIBamHIBamHI包装转化KW251噬菌斑10~23kb包装蛋白实验一、技术路线图重组噬菌体收集噬菌体液基因组文库1.GenomicDNA2.LambaDNAFig.1electrophoresisofgenomicDNA图1.基因组DNA电泳1248.5kb实验一结果2.1基因组DNA的提取提取的基因组DNA大于50kbFig.2DigestionofgenomicDNAbyBclI1.5U/ugDNABclI，2.2.5U/ugDNABclI3.1.25U/

7、ugDNABclI4.LambaDNA/HindⅢMarker图2.基因组DNABclI酶切电泳23kb9.4kb1234Fig.3Electrophoresisofrecoverproductsof10~23kbDNAfragments1.BclI酶切纯化片段2.LambaDNA/HindⅢMarker图3.10~23kbDNA片段回收产物电泳23kb9.4kb12实验一结果2.2家蝇基因组DNA酶切和纯化纯化了10~23kb的BclI酶切DNA片段实验二、家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析特异

8、性探针噬菌斑原位杂交鉴定可疑阳性克隆亚克隆文库液转化KW251噬菌斑三次纯化噬菌斑原位杂交λ-DNA提取阳性克隆单酶切和双酶切SouthernBlotHindIIIXhoI目的DNA片段测序序列分析实验二、技术路线实验二结果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATT