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时间:2018-06-12
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1、基因重组和基因工程GeneticrecombinationandGeneticEngineering一个完整的基因克隆过程包括以下步骤:1。获得待克隆的DNA片段(基因);2。目的基因与载体在体外连接;3。重组DNA分子导入宿主细胞;4。筛选、鉴定阳性重组子;5。重组子的扩增与/或表达。(基因工程技术中常用的为II类酶)EcoRIHindIII11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111*限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列
2、呈二重旋转对称(即具有迥文结构);2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端;3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端;而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端,也称钝性末端。4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点,这些酶称为同切酶或同功异源酶。5、有些限制酶识别序列不同,但切割DNA产生相同粘性末端,称同尾酶。存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。粘粒(柯斯质粒)是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒,由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成,在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复
3、制,但不表达任何噬菌体的功能。粘粒的结构特点:含有抗药性标记和质粒复制起始位点;一个或多个单一限制酶切位点;带有λ噬菌体粘性末端;分子小(4-6kb),可容纳大到40-50kb的外源DNA片段,因此适于构建真核生物基因组DNA文库。主要用于一些小的DNA片段的合成。*从基因组DNA文库获取目的基因是含有某种生物体(或组织、细胞)全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。cDNA文库cDNA是指以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库
4、。从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列(不含内含子),便于表达产生有功能的蛋白质。*构建cDNA文库的主要步骤:1。mRNA分离;2。cDNA第一链合成;3。cDNA第二链合成;4。载体与cDNA的连接;5。噬菌体的包装及转染;6。cDNA文库的扩增和保存。cDNA文库载体目的基因*平端连接(transfection)此外:菌落快速裂解鉴定法从平板上直接挑选菌落裂解后,直接电泳检测载体质粒大小,判断有无插入片段存在,该法适于插入片段较大的重组子初筛。内切酶图谱鉴定经初筛鉴定有重组子的菌落,小量培养后,再分离出重
5、组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割,释放出插入片断;对于可能存在双向插入的重组子,还要用内切酶鉴定插入的方向。通过PCR筛选重组子一些载体外源DNA插入位点两侧存在特定的序列,如启动子序列等,利用这些特异性序列作为引物,对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应(PCR)分析,不但可迅速扩增插入片断,判断是否阳性重组子,还可直接对插入进行DNA序列分析。该法能进行大规模操作,一次可筛选多达5x105-5x106个菌落或噬菌斑,特别适于从基因文库中挑选目的基因。不哺2.
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