基因工程基本原理

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1、基因重组和基因工程GeneticrecombinationandGeneticEngineering一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：1。获得待克隆的DNA片段（基因）；2。目的基因与载体在体外连接；3。重组DNA分子导入宿主细胞；4。筛选、鉴定阳性重组子；5。重组子的扩增与／或表达。（基因工程技术中常用的为II类酶）EcoRIHindIII11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111*限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列

2、呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶或同功异源酶。5、有些限制酶识别序列不同，但切割DNA产生相同粘性末端，称同尾酶。存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复

3、制，但不表达任何噬菌体的功能。粘粒的结构特点：含有抗药性标记和质粒复制起始位点；一个或多个单一限制酶切位点；带有λ噬菌体粘性末端；分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库。主要用于一些小的DNA片段的合成。*从基因组DNA文库获取目的基因是含有某种生物体（或组织、细胞）全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。cDNA文库cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库

4、。从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达产生有功能的蛋白质。*构建cDNA文库的主要步骤：1。mRNA分离；2。cDNA第一链合成；3。cDNA第二链合成；4。载体与cDNA的连接;5。噬菌体的包装及转染；6。cDNA文库的扩增和保存。cDNA文库载体目的基因*平端连接(transfection)此外：菌落快速裂解鉴定法从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。内切酶图谱鉴定经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重

5、组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶鉴定插入的方向。通过PCR筛选重组子一些载体外源DNA插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA序列分析。该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5x105-5x106个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。不哺2.