《其他重要工具酶》PPT课件

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1、第二节其它重要的工具酶DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶是催化以DNA或RNA为模板合成DNA的一类酶的总称。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐高温的TaqDNA聚合酶以及反转录酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是：它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP)连续的加到双链DNA引物链的3'-羟基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的DNA链。DNA聚合酶IDNA聚合酶I具有三种活性，即5→3聚合活性、5→3外切

2、活性和3‘→5’外切活性。DNA聚合酶I要发挥作用需满足以下三个条件。①底物和激活剂：DNA聚合酶I催化聚合反应需要四种dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作为底物，同时Mg2＋是不可缺少的激活剂。②带有3-端羟基末端的引物：DNA聚合酶I所催化的聚合反应总是在引物的3-OH末端基团和搀入的dNTP之间发生的，且只能沿引物末端由5→3方向延伸。③DNA模板：可以是ssDNA或dsDNA，后者只有在其主链上有一至数个断裂的情况下才能成为有效的模板。实验室中，利用DNA聚合酶I，通过DNA缺口平移的方法制备DNA探针，可以用于核

3、酸杂交分析。双链DNA的单链缺口在DNA聚合酶I的5→3外切作用下，从缺口的5‘端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3’端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动，这种缺口移动的现象就称为缺口平移。如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则合成产生的DNA分子即可作为带放射性标记的DNA分子杂交探针。DNA聚合酶IDNA聚合酶I大片段(Klenow片段)是E.coliDNA聚合酶I的蛋白水解产物，特点是：具有DNA聚合酶活性和3→5核酸外切酶活性，但缺失了5’→3’核酸外切酶活性。Klenow既保留了全酶的高保真

4、性，又不会降解DNA5末端。用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记DNA，同时也可用于DNA的缺口补平和延伸。用途：用随机引物制备探针补平5突出端，形成平末端切除3突出端，形成平末端合成cDNA第二条链诱变反应中第二条链的合成双脱氧法DNA序列测定(Sanger法)DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)T4DNA聚合酶在模板及引物存在的条件下，T4DNA聚合酶催化沿5'→3'方向合成DNA。此酶还具有3'→5'外切核酸酶的活性，该活性比DNA聚合酶I强。与E.coliDNA聚合酶I不同，T4DNA

5、聚合酶不具有5'→3'外切核酸酶活性。T4DNA聚合酶■ 缺口填充(无链置换活性)■产生平末端的最佳用酶■ 补平5'突出端，形成平末端■ 切除3'突出末端，形成平末端■ 通过置换合成法标记探针■ 单链删除后亚克隆■ 基因定点突变中第二条链的合成DNA片段的末端平滑化示例T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶是从受T7噬菌体感染的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶。它由两种亚基组成：一种是T7噬菌体基因5编码的蛋白质，其分子量为84kD；另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白(thioredoxin)，其分子量为12kD。T7DNA聚

6、合酶是目前已知的持续合成能力最强的DNA聚合酶，能连续合成数千个核苷酸。除聚合活性以外，T7DNA聚合酶还具有单链和双链的3‘→5’外切酶活性，它的活性也很强，约为Klenow酶的1000倍。T7DNA聚合酶不具有5‘→3’外切酶活性。由于T7DNA聚合酶的高度续进性和不受DNA二级结构的影响，在分子生物学中常被用于长模板DNA的引物延伸反应。同时，经修饰的T7DNA聚合酶还是双脱氧终止法对长片段DNA进行测序的理想工具酶。T7DNA聚合酶碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase）碱性磷酸酶是一类能特异性地切去DNA或RNA的5‘-磷酸

7、基团的工具酶，它们的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。用途1）去除DNA片段的5’-末端的磷酸基。防止线状DNA的自身环化（Self-Ligation）。2）除去PCR反应后残存的dNTP。PCR产物进行测序时，在反应体系中如果有多余的Primer和dNTP，将影响测序反应的正常进行。使用ExonucleaseI分解残存的Primer；用SAP处理可降解多余的dNTP，之后不需要对PCR产物进行精制，立即可以进行测序反应。从细菌中分离的碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,E.coliC75;B

8、AP)从小牛肠中分离的碱性磷酸酶(Alkalinephosphase,calfintestinal,CAP)。从虾提取的虾碱性磷酸酶（S