WB的转膜和染色

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1、WB的转膜和染色凝胶中蛋白的可视化在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用铜染色法，因为考马斯染色不可逆。考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜效率；不需要转膜，只需观察 SDS-PAGE 结果。 考马斯染色切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散（溶于水溶液）。为了防止蛋白的扩散，用 40% 蒸馏水、10% 醋酸、50% 甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。 为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比 0.25% 的考马斯亮蓝 R-2

2、50，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育 4 小时至过夜。接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到 67.5% 蒸馏水、7.5% 醋酸、25% 甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。 染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。 铜染色法用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多 30 分钟），然后转移至 0.3MCuCl2 溶液染色5–15 分钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。凝胶可以用 0.1–

3、0.25MTris/0.25MEDTApH8.0 重复冲洗至完全脱色。根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。转膜转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS 提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持

4、凝胶与膜之间的紧密接触。在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵 > 滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸 > 海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入了甲醇至终浓度 20%。对于分子量大于 100kDa 的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为 0.1% 的 SDS。在半干法转膜中，三明治由滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸组成，在转膜缓冲液

5、中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。 半干转的转膜缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是 48mMTris、39mM 甘氨酸、0.04%SDS、20% 甲醇。有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和 PVDF膜，实验效果都很不错。PVDF 膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡 1–2 分钟。之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育 5 分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。小分子和大分子蛋白的转膜转

6、膜缓冲液中 SDS 和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以增加转膜效率：大分子蛋白 (>100kD)对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。 ·大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。·降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容

7、易转膜。·只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。·选择湿转4°C过夜，不建议选择半干转。小分子蛋白 (<100kD)·SDS妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加SDS。··保持甲醇的浓度20%。·对于500kD的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：BoltMWandMahoneyPA(1997).High-efficiencyblottingofproteinsofdiversesizesfollowingsodium

8、dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis.AnalBiochem,247,185–92.更多转膜提示：·使用镊子，避免手指接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。·将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过