蛋白核酸杂交转印膜(PVDF膜和尼龙膜)介绍

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1、蛋白、核酸杂交转印膜（PVDF、尼龙膜）技术介绍转印膜：用于蛋白质和核酸的转移和检验过程的微孔膜。Southernblot：又称Southern印迹杂交，是研究DNA图谱的基本技术。Northernblot：又称Northern印迹杂交，与Southernblot方法类似，是检测RNA的基本技术。CobetterWesternblot：又称Western印迹杂交，与Southernblot方法类似，是蛋白质检测分析的基本技术。转印膜在蛋白质和核酸的转移和检测过程中应用广泛，不同的转印膜规格和参数不同，选择正确、均一稳定的转印膜对达到最佳的实验结果起到关键性的作用。常用的转印膜对比：常用的

2、三种转印膜：硝酸纤维素膜（NC膜）、带正电的尼龙膜（N66膜）、聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）。三种转印膜结合DNA或RNA的能力：带正电尼龙膜>PVDF膜>硝酸纤维素膜。三种转印膜机械强度比较：硝酸纤维素膜较脆，易破碎，不能重复使用；尼龙膜和PVDF膜机械强度较高，可重复使用。带正电的尼龙膜可结合短至10bp核酸片段，因此是最理想的核酸杂交转印膜。PVDF膜机械强度高、耐高温，是蛋白印迹最理想的转印膜。Cobetter专为蛋白核酸杂交研发了性能优良的转印膜，Cobetter杂交转印膜的种类如下：CobetterN66尼龙转印膜N66尼龙带正电荷转印膜PVDF疏水转印膜PVDF亲水转

3、印膜Cobetter转印膜孔径有0.45um、0.22um两种。CobetterN66尼龙转印膜：相比起硝酸纤维素膜而言，其机械强度高，在经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，可重复使用，非常适用于核酸检测。制模过程中通过特殊的表面改性方法嫁接了亲水性的基团，使用过程中不需要再做预润湿处理。Cobetter通过在膜表面嫁接羟基基团，改变其表面电荷性能（正电），使得其能紧密结合DNA而降低背景，快速结合DNA。溶剂兼容性：能够抵抗普通溶剂，比如丙酮、酒精、氯化脂肪族烃、甲酰胺、2M氢氧化钠、DMSO以及二甲基甲酰胺。但耐酸能力非常有限，与浓缩蚁酸（>50%）、盐酸（>4摩尔）

4、、氧化剂不兼容，不能长时间暴露于pH<2的酸性环境中。主要应用：放射性和非放射性核酸杂交，如：Southern，Northern，DNA斑点杂交CobetterPVDF疏水转印膜：疏水PVDF膜可结合蛋白和核酸，但主要应用于蛋白的固定和检测。PVDF膜逐渐取代NC膜成为主流蛋白质转印膜材料，其主要优点如下：与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜韧机械强度高，不易破裂、卷曲，耐热性好，可以Cobetter重复使用。高蛋白结合能力，灵敏度高，背景低。与众多染料或染色剂相容性好。膜孔径越小，对蛋白的结合能力越强。主要应用：蛋白转移、测序、蛋白点、狭线杂交等实验Cobetter转印膜规格：常规的

5、尺寸如下，根据不同需要可进行分切：片膜：7*8.5cm片膜：10*15cm片膜：φ82mm、φ132mm卷膜：20cm*3m卷膜：30cm*3m转印膜具体技术信息和使用时的注意事项关注Cobetter官网介绍。2015年3-5月Cobetter提供样品试用。下面主要介绍蛋白核酸杂交的基本流程以及转印方法、转印注意事项、蛋白核酸检测过程中常见问题分析的一些个人总结。蛋白、核酸杂交基础知识和常见问题分析：Southern杂交实验流程：Cobetter转膜方法：1毛细管虹吸印迹法此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。操作简单，不需要特殊装置，但转移效率不高，

6、尤其分子量较大的DNA片段。2电转移法通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到滤膜上。尤其适用于毛细管虹吸法转移不理想的大片段DNA。3真空转移法在真空条件下，DNA和RNA可从凝胶中快速并定量地转移。较之毛细管转移更为有效，而且极为快捷。转膜注意事项：1要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2MHCl预处理10min使其脱嘌呤。2不可用手触摸转印膜，否则影响DNA的转移以及与膜的结合。3转移时，凝胶的四周要蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时Cobetter注意转印膜与凝胶及滤纸间不能

7、留有气泡，以免影响转移。核酸检测中常见问题及可能的原因分析：核酸检测常见问题可能的原因探针标记效率低探针浓度低转印膜漂洗过度灵敏度低核酸转移效率低核酸在转印膜上固定不牢固检测条件不合适探针浓度高预杂交不完全或封闭效率低背景高转印膜漂洗不到位操作过程中膜完全干燥Cobetter杂交液中有杂质Westernblot流程图：转印方法：湿转和半干转两种。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长