HPLC方法建立和优化

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1、HPLC方法的建立和优化绪论目录分离的基础2色谱柱3样品分离的系统方法4梯度洗脱51定性和定量分析目录6方法的完善7绪论色谱仪器介绍色谱仪器：控制器输液泵储液瓶溶剂组织器进样器色谱柱（柱温箱）检测器色谱仪器介绍原理图：输液泵进样器色谱柱检测器色谱工作站储液瓶HPLC方法建立的步骤HPLC方法建立的步骤一、样品的性质，确定分离目的二、是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等三、选择合适检测器并确定检测参数四、选择液相色谱法，进行预实验，估计最佳分离条件五、优化分离条件HPLC方法建立的步骤六、检查出现的问题或所需的特殊步骤七、分析A、回收纯化物B、定量校正C、定性方法八、论证方法使之进入常规

2、实验室样品的性质，确定分离目的了解样品的相关情况：所含化合物的数目；化学结构（官能团）；分子量；pKa值；UV光谱图；被测组分在样品中的浓度范围；样品的溶解度、沸点及其稳定性；可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。要分离的化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物1.1样品具有什么样的性质？定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？是否分析所有组分？定性？一种条件有困难？分组分析？定量分析的准确度和精密度？（主成分精密度在±1～2％）不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。实验室的条件

3、，如HPLC仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温？是否可以做梯度？分析成本？实验室人员的操作技能如何？方法是否具有可移植？等等。1.2明确分析目的可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）需稀释、pH缓冲、加内标或其它操作固体样品－选择合适的溶剂溶解后进样需提取分离的样品预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。总之，将样品溶于合适的溶剂；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率1.3样品的预处理与检测按照样品的特性分为以下二类：A一般样品（分子量<2000）可采用基本标准的方法。（中性的、离子的）－反相、离子对、非水反相、正

4、相、离子交换B特殊样品无机离子：离子色谱异构体：手性分析对映体、生物样品：肽类、核苷酸大分子：蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。需要大孔径色谱柱填料（》10nm孔径）等等1.4HPLC方法建立1.5HPLC首选方法建立方法/特点/色谱柱适用范围反相HPLC流动相：水－有机溶剂能溶于水－有机溶剂的大部分样品，中性或非离子化合物色谱柱：C18、C8、苯基、三甲基硅烷（TMS）、氰基离子对HPLC流动相：缓冲液（加离子对试剂）－有机溶剂离子或可电离化合物，尤其是碱或阳离子样品色谱柱：C18、C8、氰基正相HPLC流动相：有机溶剂混合液不溶于水－有机溶剂的亲脂样品，异构体等样品色谱柱：氨基、硅胶、氰

5、基、二醇基方法特性：1.5HPLC首选方法建立分离条件较好的首要选择色谱柱尺寸（长度，ID）150×4.6mm粒度5µm固定相C18流动相溶剂A和B缓冲液－乙腈%B80~100%缓冲液（化合物、pH、浓度）25mM磷酸钾，2.01.5样品保留值0.52000

6、(理论踏板数）溶剂消耗越少越好目标：1.6HPLC方法优化合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法的稳定性。对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切实可行的办法。建立合理的数据处理方法等。1.6方法的优化1.7完善HPLC方法定性与定量方法的建立及论证。对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定的分析方法。解决出现的问题方法的可移植性1.7完善HPLC方法1.7完善HPLC方法问题1、柱效低2、色谱柱寿命短3、保留值变化4、定量精度差5、出现干扰峰6、峰严重拖尾或前趋7、分离度不够，峰不能完全分开经常

7、出现的问题：二、色谱柱基础知识（一）2.1色谱柱的性能指标1、柱效率:N实际工作中一般取1/2峰高处计算柱效（保留时间）：N=5.54×（tR/t1/2）2基本理论踏板数计算公式：N＝σ[VR/W]2WσMethodWtan16切线法W1/2h5.54半峰高W3σ93σw4σ164σw5σ255σVRtRvR50%32.4%13.4%4.4%WW3σW1/2hW5σW4σtR2.1色谱柱的性能指标1、柱效率:NW5σW4