HPLC分析方法的建立与开发课件1.ppt

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1、建立分析方法色谱分离度与分离性能HPLC分离的机理色谱工作者关心的基本问题-色谱峰之间的分离度totRAmAUtimetRBR=分离度tRA=组分A的保留时间tRB=组分B的保留时间w=峰的基线宽度w1/2=半峰宽分离度值等梯度洗脱的基本分离度公式N:总的理论塔板数;柱效k:容量因子(保留因子),色谱峰的保留作用α：色谱峰的相对分离程度;选择性作用影响分离度的因素容量因子对分离度的影响容量因子-----流动相组成的影响选择性影响选择性的参数降低增加较弱的溶剂较强的溶剂异丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18

2、容易超载不容易超载改变流动相组成改变固定相有机成分含量低的固定相有机成分含量高的固定相色谱柱温度对分离度的影响柱效计算柱效典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.09柱内径mm(5um粒度)mL/minflowrate2=i.d.2i.d.12flowrate1柱外体积的影响10µL20µLTime,min.2.1x150mmF=0.2mL/min.样品体积连接管路的体积检测器体积检测器电子线路的时间常数所需分离度与柱长匹配峰对称性提高分离度增大k'增加选择性提高

3、柱效分离度与k,n和的关系液相色谱流动相及固定相流动相与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。1、理想的溶剂应有下列特性1）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应2）必须和检测器相适应★使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长★使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别3）对待测物具一定极性和选择性4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂5）适宜的粘度★粘度过高

4、，柱压增加★过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡2、溶剂的极性溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。序号溶剂紫外波长极限（nm）序号溶剂紫外波长极限（nm）1异辛烷1979氯仿2452正己烷19010二氧六环2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氢呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水2003、流动相的选择4、梯度洗脱特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以

5、增加灵敏度，会引起基线漂移固定相化学键合固定相方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填（约有3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行）特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗分离机理：兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。载体主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为：♫可以制备成粒度分布窄的多种粒度♫机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床♫长期高压操作下不变形♫反压较低、柱寿命长♫较其它材料制成的柱有更高的柱效♫适用于小分子、大分子的分析和

6、制备♫高pH值下会分解（pH＜8）键合方法：（l）硅酯化（≡Si-O-R）键合固定相（2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相（3）硅烷化（≡Si-O-Si-R）键合固定相使用键合固定相应注意的问题♫硅胶键合相的稳定性♫键合相色谱分离的重现性♫键合相色谱分离的选择性♫键合相色谱柱的再生化学键合相色谱法正相色谱和反相色谱反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进

7、行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱反相色谱固定相极性大小流动相极性小至中等中至大组分流出顺序极性小的组分先流出极性大的组分先流出流动相极性增大保留时间变小保留时间变大分离组分油溶性或水溶性的极性和强极性化合物非极性、极性或离子型化合物正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相键合相色谱法固定相：正相色谱中采用极性键合固定

8、相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有胺基、腈基、醚基的极性固定相。流动相：在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。反相键合