实用hplc方法的建立

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1、实用HPLC方法的建立2021/9/16目录1前言2HPLC方法建立的步骤2.1了解样品的有关情况2.2明确分析目的2.3样品的预处理与检测2.4HPLC分析模式的选择2.5色谱条件2.6方法的优化，及色谱现象的解析和处理2.7定性和定量方法的建立及论证3色谱条件的选择3.1流动相的选择3.2检测器的选择3.3样品的溶解及预处理3.4样品的进样量3.5色谱柱的选择及保护与再生3.6泵的选择3.7色谱工作站4分析方法建立的实例4.1等度分析4.2梯度方法的建立4.3色谱柱及pH的影响5色谱分析中各种图谱现象的判断5.1基线噪音的产生和处理5.2基线漂移(上漂和下漂)5.3倒峰的产生和消除5.4

2、鬼峰的产生和消除5.5峰前移和退后的判断5.6前沿峰和拖尾峰的判断5.7色谱双峰的判断5.8色谱峰变胖的判断和处理1前言HPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。HPLC技术的发展和科技的进步，使得HPLC广泛应用到各个领域。HPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。HPLC技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。出的来，跑的快，分的开2HPLC方法建立的步骤2.1了解样品的有关情况首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的（同一样品，不同的测试要求，其方法也可

3、能不一致）。样品的重要性质包括：所含化合物的数目；化学结构（官能团）；分子量；pKa值；UV光谱图；被测组分在样品中的浓度范围；样品的溶解度、沸点及其稳定性；可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。1分析大分子、小分子还是生物分子一般常规的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。2样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。3测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要

4、考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。4分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的pH。离子化合物可以采用反相，调节pH；或者添加离子对试剂；也可采用离子交换。两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。对于极性的糖类物质，可用NH2柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。手性化合物，则要用手性流动相

5、或者采用手性柱。5样品的溶解度、沸点样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型。非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同pH下区别可能很大。极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度。从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。易挥发性的低沸点的物质在ELSD中难以检测。有存在特例。6样品的稳定性如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。对光敏感物质，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，随配随做。易水解的物质、要选择合适的溶解溶剂。有些

6、样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节pH，如PAP的测定。胺类化合物。产品不稳定的化合物，分析越快越好。7化合物的化学结构（官能团）常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOH、OH、NH2、SO3H、Cl（Br）、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。8化合物的pK值知道pK值，有助于方法的建立，尤其流动相pH的选择。pK的差异是官能团造成的。9UV光谱图知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有DAD则关系不

7、大。多组分的样品，宜多选几个波长。同一样品在不同的流动相及pH最大波长可能不一致。有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收10样品的复杂程度梯度方法分析预处理,分成几个部分分析痕量物质的富集总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。2.2明确分析目的1定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？2是否将所有组分分开，定性？一种条件