hplc实验步骤和方法开发

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1、液相色谱的应用以及方法开发提纲：一.HPLC的广泛应用二.方法开发过程一）选择HPLC检测器二）分配色谱及选择流动相三）方法开发的具体步骤四）梯度洗脱方法一.HPLC的广泛应用据2004年统计，世界上化合物总数多达4700多万种在全部有机化合物中仅有20％左右的样品适用于GC分析而HPLC可对80％左右的有机化合物进行分离和分析HPLC的广泛应用HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。HPLC的应用领域在食品研究中的分析应用食品中的天然成分碳水化合物类脂

2、化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素〕维生素污染物霉菌（黄曲霉毒素〕农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸HPLC的应用领域在医药研究中分析应用药物分析有USP、BP、CP等标准常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类手性药物研究中的应用：

3、光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。在兽药研究中分析应用HPLC的应用领域在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品HPLC的应用领域化妆品行业要控制和分析：防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；在公安、刑警破案工作需要投毒药物、毒品分析等在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、

4、农药残留、酚类和胺类的检测在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析二.方法开发的过程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到样品信息，确定分离目标2.确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求3.选择合适的检测器4.选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件5.优化分离条件6.检查特定过程的问题及需要7.定量校正8.日常使用的确认第一步干什么?想办法得到各种

5、信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---仪器制造商的文献，如Dionex,Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?分离(制备)时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成?使用文献方法注意点色谱柱填

6、料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）一）选择HPLC检测器对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距用于HPLC的检测器没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！HPLC检测器可以分为：溶质

7、性质检测器（选择型）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）整体性质检测器（通用型）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好