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《分子生物学技术和食源性致病菌的快速检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、分子生物学技术和食源性致病菌的快速检测与细菌有关的一些分子生物学和细胞生物学技术;PCR技术;荧光PCR技术;相关的一些分子生物学技术在食源性致病菌的快速检测技术中的应用;5.一实例分析个案与细菌有关的一些分子生物学和细胞生物学技术核酸的抽提与纯化(DNA,RNA,质粒DNA等)相关核酸的鉴定(PCR,限制性内切酶和酶切技术及产物分析,重组技术,探针,Southernblotting,Northernblotting,芯片技术,序列分析等)蛋白质的提取与纯化相关蛋白质的鉴定(Westernblotting,
2、抗原抗体复合物,标记技术,芯片技术,序列分析等)培养细胞技术(用于细菌毒素测定的MTT方法)核酸的抽提与纯化DNA-微量法(平衡酚,氯仿,乙醇);大量法(碱列解);离心法RNA质粒DNA-碱变性法,Kit-Qiagen公司PCR产物-Kit细菌-直接裂解:释放出DNAPCR-聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）在体外通过酶促反应进行一段特定DNA或RNA片段扩增的技术为获取目的DNA片段的一项常规技术(诊断和检测)原理:PCR一般过程：1.变性（denaturation）
3、：加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DNA。2.退火（annealling）：温度降低时使引物和其互补的模板在局部形成杂交链。3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸及Mg2＋存在的条件下，催化DNA链延伸反应。模板DNA或RNA一对寡核苷酸引物4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)热稳定的聚合酶(Taq)；Mg+缓冲液。PCR-聚合酶链式反应体系凝胶电泳：经溴化乙锭染色，在紫外照射下可见橙红色的特异DNA扩增带并可以在图象成像仪下成像。PCR-聚合酶链式反应产物的检测M1
4、2345678NPPCR-聚合酶链式反应技术的发展不对称PCR反向PCR多重PCR差别PCR荧光PCR锚式PCR重组PCRPCR固相分析免疫PCR反转录PCR(RT-PCR)原位PCR………荧光PCR技术(RealTimePCR)荧光是响应于一个短波光的激发，一个长波长光被发射出来每个荧光分子都有一个最有效的激发波长-被激发的荧光分子越多，发射的荧光越强荧光PCR技术(RealTimePCR)PCR+荧光标记+监测系统Non-specificDNAbindingdyesSYBR®GreenIEthidium
5、BromideSpecificHybridizationProbesTaqManTMmolecularbeaconsdual-oligoFRETpairs荧光PCR技术(RealTimePCR)R5‘3‘3‘5‘RRRRSYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA染料,与双链DNA结合后,其荧光大大增强.RRR497nm520nm荧光PCR技术(RealTimePCR)TaqMan:杂交探针的互补区在引物间5’端连有一个荧光reporter,通常是荧光素3’端连有一个Quencher,通常是TAMRA
6、荧光素被488nm光激发，发射光为520nm520nm光能激发TAMRA，发射光为570nmRQ5‘3‘3‘5‘R=ReporterQ=Quencherprobe荧光PCR技术(RealTimePCR)分子Beacons:探针有核心的杂交区探针有自互补末端在未杂交时探针呈发夹状报道子,荧光素在探针的5’端猝灭子在探针的3’端FRETProbes5’3’5’3’l3’DR5’DetectionExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementSystemSilent2.Polymeri
7、zationCompleteSystemSilent5’3’3’5’Taq3’DR1-5basesDRTaq5’R5’荧光PCR技术(RealTimePCR)阈值线CT值阈值线:荧光阈值的缺省的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍.CT值:各反应管内的信号到达设定的阈值所经历的循环数.荧光PCR技术(RealTimePCR)阈值线CT值多重荧光PCR技术FAMVICHEXTETCy3TexasRedROXCy5LC640Cy5.5LC705490nm660nmR限制性内切酶和酶切技术及重组限制性内
8、切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶.例如:EcoRI可以识别5‘…….GAATTC….…3’3’…….CTTAAG…….5’粘性末端T4连接酶:重组酶切与多态性分析技术,GFP-MIP重组结构MIPmip基因是军团菌的巨嗜细胞感染增强子基因，具高度保守性和嗜肺军团菌种的特异性。表达的产物mip蛋白是迄今所公认的嗜肺军团菌毒力因子之一，是嗜肺军团菌所特有，因此用来鉴定军团菌具有很强的特异性
