快速检测肠道致病菌的PCR技术的研究

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1、西华大学硕士学位论文快速检测肠道致病菌的PCR技术的研究姓名：代娟申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：李玉锋20070501快速检测肠道致病菌的PCR技术的研究食品科学专业研究生代娟指导教师李玉峰摘要食品安全是一个越来越引起人们重视的问题，不仅影响到人们的生活、工作和健康，更是关系到国计民生的大事。在各种食物中毒中，细菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。食品中的肠道致病菌是引起人类食源性疾病的主要原因之一，而传统的病原微生物检测耗时长，操作烦琐，对有些细菌也不能给出理想的鉴定结果，在实际运用中遇到越来越多的问题

2、。鉴于此，我们对当前最先进、最敏感的PCR检测技术进行研究，在于建立快速简便、定量准确、灵敏度高、特异性强、经济实用的检测方法。本文针对在我国食物中毒中最常见的肠科杆菌进行研究，寻找食物中毒诊断及医疗卫生检验的有效途径。本文涉及的肠科杆菌有产肠毒索大肠埃希菌、侵袭性大肠埃希菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等。，多重PCR是在同一PCR反应体系中加入二对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR具有高效性，系统性，经济简便性等特点。首先筛选出种或属问特异性基因序列，按照引物设计原则设计引物，进行PCR扩增。

3、通过调整MgCl2浓度、引物浓度、Taq酶用量、模板浓度、退火湿度和循环数参数等，优化多重PCR反应体系。这些目的基因的引物在一个混合的PCR体系中扩增出各自的基因片段，并且特异性、灵敏度都和单独PCR扩增近似，几种菌随机组合的扩增也很成功，未出现相互间强抑制现象。所用时间也与单独PCR相同，从处理样品开始仅需要2～3h就可得到结果。同时我们对样品的检测与食品卫生微生物检验标准的符合率达100％。组装的试剂盒稳定性和重复性很好，因此该试剂盒有一定的应用价值，可在生产实践中推广应用。实时荧光定量PcR技术具有灵敏度高

4、、特异性好、无需PCR反应后处理步骤等优点，近年来广泛应用于食品和临床检验方面。本研究针对编码产肠毒素大肠埃希菌的耐热肠毒素STI和不耐热肠毒素LTI的基因片段设计引物、探针，分别使用的是MGB．Taqman探针和普通的Taqman探针。制备阳性标准品，探索实时荧光定量PCR反应体系和反应条件，检测PCR反应液中的荧光强度，得到荧光定量PCR的反应啦线。由于D值与起始模板的对数存在线性关系，绘制实时荧光定量PCR反应的标准曲线，使我们能对样品进行绝对定量。实时荧光定量PCR反应系统的特异性强，灵敏度高，对样品的检测

5、与参比方法的符合率为100％，无漏检的可能性。反应系统的稳定性和重复性也很好，整个过程可在2h内完成。该方法具有其他方法无可比拟的优点，随着该方法的进一步完善，可成为获得国际认可的检测产肠毒素大肠埃希菌的最理想的标准方法。关键词；肠道致病菌，多重PER，实时定量PCR，检测ⅡRapiddetectionofenteropathogenwithPCRassayFoodseieneeCandidateDaijuanSupervisorLiyufengAbstractTheproblemoffoodsafetyisbec

6、omingmoreawakedandmoreseriousforpeopleinmanycounties．Itisassociatedcloselywiththenationaldevelopmentandpeople’Slife,jobaIldhealth．Themostlyfactoroffoodpoisoningisbacterialfoodpoisoning．Theoneofreasonscausinghumanbeingdiseaseisenteropathogeninfood．Thetraditiona

7、ldetectionofpathogenymicroorganismneedalongtime，operationwithtrivialdetails．Meanwhile，thetraditionaldetectionCan’tgetaperfectlyidentityresultfromsomebacteria．Therearemoreandmoreprobleminourpractice．So，westudythebestadvancedandsensitivePCRtechnologypresently抽de

8、veloparapid,simple．precisequantity,sensitivity,speciality,economicdetectingmethod．WestudythefamiliarEnterobacteriaceaeinourfoodtogetaefficaciousapproachoffoodpoisoningdiagnoseandme