食源性致病菌阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌lamp快速检测技术的建立与初步应用

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文食源性致病菌阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用EstablishmentandapplicationofLAMPmethodforrapiddetectionoftwofood-bornepathogens课题来源：广东省科技计划项目：20098030803040专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病原生物学曾桂芬龙北国教授江丽芳教授周荣教授彭涛教授黎诚耀教授芮勇宇教授论文评阅人吴清平教授陈清教授2012年5月15日广州碰士学住论文食源性致病菌阪崎肠杆菌

2、和痢疾志贺菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用一、研究背景和目的硕士研究生：曾桂芬指导教师：龙北国教授摘要近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。随着经济发展和技术进步，食源性疾病并未减少或消失，世界范围内食品安全恶性事件反而接连发生，食品安全形势严峻。目前，食源性致病菌的检测存在特异性差、操作繁琐、耗时，以及不能现场应用等问题。本研究旨在建立阪崎肠杆菌(EmerobacterSakazakii)和痢疾志贺苗(

3、砌‘胖『，口dysenteriae)两种常见食源性致病菌的快速检测方法。阪崎肠杆菌是一种重要的食源性致病菌，呈世界性分布，主要通过晏幼儿配方奶粉经消化道感染儿童．引起新生儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎．甚或遗留神经系统后遗症或导致死亡。目前．引起阪崎肠杆菌感染事件的发生规模呈明显上升趋势，已成为我国重要的食源性致病菌。国际食品微生物标准委摘要地会十2002年将贩崎肠杆茼列为对特定人群产生f“重的7￡命危害或产生慢性后遗症的微生物。陶家质检总局于2005年8』j颁布了检测阪崎肠杆菌的行业标准SN／T1632l。2006年，针对婴幼

4、儿配方乳粉受阪崎肠杆菌污染的高风险性和污染后的巨大危害性，国家质检总局颁布了婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌每批必检的市场准入要求。检测阪崎肠杆苗的传统方法步骤繁琐，一般须耗时6d左右，近年来圜内外相继建立了ELISA、PCR、核酸杂交等检测技术。痢疾志贺菌是人和动物肠道内寄生的革兰阴性无芽胞杆茁，是一类具有较强传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌，所致的细苗性痢疾(Shigellosis)是世界上尤其是发展中国家重要的传染病之一，全球每年细菌性痢疾病倒高达l65亿，其巾163亿发生在发展中国家，并导致110万患者死1、：，其巾60％

5、以上为5岁以下儿童。近年来，痢疾志贺苗食物中毒的发生规模呈明显上升趋势，成为我国首要的食源性致病菌之一。目前，我国常用的志韬氏蔺的检验方法主要是国标法(GB／T47895—2003)。整个检测程序需要3～5d完成，检测时间长，检出限为104CFU／mL。免疫学方法简单，但灵敏度不高；PCR方法具有灵敏、快速等优点，但检测成本较高，仪器昂贵，1：适于基层单位推广出Hj。综上，建立准确、灵敏、操作简便、不依赖昂贵仪器的榆测方法对于食源性致病菌感染的诊断、疾病控制和流行病学调查具有重要意义：发展快速准确、操作简便的检测与鉴定阪崎肠杆菌

6、和痢疾志贺菌的方法成为相关研究的热点。目前，常用快速检测方法主要有ELISA、DNA探针、常规PCR、Real-timePCR等。环介导等温扩增技术(100p—mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新颖的核酸扩增技术，依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件F高效扩增核酸，具有高特异性、快速、灵敏、操作简便等特点。自从2000年以来，LAMP技术在临床疾病的诊断、枘坛¨细m或j㈣·“n，￡性枪删以及动物胍』】fi性刖络定等山向心川』泛。

7、LAMP技术在困内起步较晚，应用LAMP技术检测阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌在国内外文献巾报道较少。Il硕士学位论工本研究针对阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因和痢疾志贺茵ipaH基因，分别设计相应的LAMP引物，建立优化的反应体系，考察特异性和灵敏度，并应用于食品样品的直接检测，初步建立阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌的LAMP检测方法。二、研究方法1．阪崎肠杆菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用(1)阪崎肠杆菌LAMP检测技术的建立根据GenBank公布的阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因序列(Accessionnumber：DQ000206)的

8、保守区，利用LAMP专用软件PrimerExplorerversion4设计一套特异性引物，即外引物F3和B3、内引物BIP和PIP。以阪崎肠杆菌(ATCC29544)提取的DNA为模板，建立检测阪崎肠杆菌的LAMP检测技术体系，并对反应体系内各反应条件进行优化