Abi定量PCR原理-upda

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1、报告人：刘雪燕Tel:8008302001广州,8008203939上海，8008100192北京，Email:liuxy@appliedbiosystems.comhttp://www.appliedbiosystems.com.cn2005年6月22日昆明欢迎参加美国应用生物系统公司基因分析技术进展讲座！ABI公司荧光定量PCR仪器介绍第一代荧光定量PCR仪---1995年推出全世界第一台7700型荧光定量PCR仪---1997年推出5700型荧光定量PCR仪第二代荧光定量PCR仪---2000年推出7900型荧光定量PCR仪---2001年推出

2、7000型荧光定量PCR仪第三代荧光定量PCR仪---2004年推出7300型荧光定量PCR仪---2004年推出7500型荧光定量PCR仪荧光定量PCR原理TaqMan探针法SYBRGreenI染料法TaqMan探针法5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan®ProbeRQPolymerizationTaqMan探针法5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerRQDisplacementTaqMan探针法5’3’5’5’3’5’QRCleavageTaqMan探针法5

3、’3’5’5’3’5’RQPolymerizationCompletedSYBR®Green1染料法DNATargetSequenceDenaturationSYBR®Green1---DoubleStrandedDNABindingDyeAssaysSYBR®Green1染料法PolymerizationCompletePolymerizationTaqMan探针法定量的特点Highspecificity---primerandprobebasedhighaccuracyMultipleReporter---MutationDetectionSYB

4、R®Green1染料法定量的特点Primer-basedspecificityTargetidentification(screening)assaysConvenientthanTaqmanLow-costassayswherehighspecificityisnotrequiredCannotdomutationDetection荧光定量PCR仪的应用定量检测绝对定量病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核点突变检测与疾病相关的等位基因点突变检测SNP检测荧光定量PCR仪的应用应用一:核酸定量检测（绝对定

5、量）定量PCR技术原理在定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。Ct值的确定AmplificationoftheTemplate(50-5x108copies)StandardCurveoftheTemplate(50-5x108copies)Sample1Sample2相对定量研究基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究荧光定量PCR仪的应用应用三:突变检测，SNP分析，等位基因分析突变检测GCACFAMV

6、ICGTATFAMVICNFQMGBNFQMGBNFQMGBNFQMGB正常(Allele1)–只有VIC™绿色荧光突变(Allele2)–只有FAM™蓝色荧光终点结果1/11/2杂合子2/2空白对照实时结果NFQMGBRNFQMGBR:ReporterDye:Non-FluorescentQuencher:MinorGrooveBinder(TmEnhancer)StructureofTaqMan®MGBProbesMGB荧光探针的好处无背景荧光Nobackgroundfluorescence更好的淬灭效果BetterQuenchingeffici

7、ency荧光标记灵活Increasesflexibilityforfuturedyeadvancements提高荧光信号的信噪比提高退火温度(e.g.15merupby18°C)探针短AllowsforShorterprobes提高SNP识别率IncreasedDiscriminationPowerinSNPassaysABI公司荧光定量PCR试剂ReagentkitsABI试剂盒3大优势1st预防污染Uracil-N-Glycosylase(UNG)Actsonsingle/double-strandeddU-containingDNAUUUU50

8、°C,2min.AddUNGUNG酶金牌Taq酶经过修饰，常温下没有活性95℃10min热启动后才能做PCR