ABI 荧光PCR原理及应用

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1、荧光PCR原理及应用周煜ZHOUYuApplicationSpecialistcnmcbsupport@appliedbiosystems.comABI公司及其荧光PCR仪器美国ABI公司荧光定量PCR仪发展历史1995－世界上第一台定量PCR仪7700型1997－向医院用户推出5700型定量PCR仪2000－推出7900型384孔荧光定量PCR仪}公认最高端定量PCR仪2001－7900型96孔荧光定量PCR仪2001－推出7000型荧光定量PCR仪取得巨大成功2003－获得了荧光定量PCR仪专利－确立ABI在业界内的独特地位2

2、004－第3代荧光定量PCR仪7300和7500型2007－第4代荧光定量PCR仪StepOne和StepOnePlus3ABI公司荧光PCR仪器4ABI公司荧光PCR仪器AppliedBiosystems7900HTFastAppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystemReal-TimePCRSystemAppliedBiosystemsStepOne™Real-TimePCRSystemAppliedBiosystems7300AppliedBiosystems7500Real-Time

3、PCRSystemReal-TimePCRSystem5各种荧光PCR仪器6荧光PCR的化学两种荧光化学原理●Fluorogenic5’NucleaseAssay–Anestablishedandprovenchemistryforhighspecificitynucleicacidreal-timequantitation–TheintroductionofTaqMan®MGB(MinorGrooveBinder)probeshasproducedaturn-keyhomogeneouschemistryforthedetect

4、ionofSingleNucleotidePolymorphisms(SNPs)●SYBR®Green1DoubleStrandedDNABindingDyeAssay–Idealfortargetidentification(screening)assays–Alower-costalternativewhenhighspecificityisnotrequired8TaqMan探针5’3’5’3’3’5’ExcitationRRRQExcitationRQ3’5’9TaqManMGB探针(non-fluorescentquen

5、cher)NFQQRQAGGCCTTGAGAGATATMGB(minorgroovebinder)提高探针Tm值RAGGCCTTGAGAGATATQ

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21、GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACR报告荧光NFQ无荧光淬灭基团MGB小沟结合物10MGB探针的优点●提高淬灭效率●减少背景、提高信噪比●提高探针Tm值–长15碱基，提高18°C●缩短探针长度–最佳范围13-21碱基11TaqManMGB探针鉴别等位基因NFQQR5′3′MGBFAMMGB分辨1个碱基的精确度完全配对，有

22、信号FAMMGB一个碱基不配对，没有信号12SYBRGreen染料SYBRGreenI与dsDNA结合与DNA结合时游离时光13融解曲线(Dissociationcurve)●EasilycheckforspecificityofyourSYBRassaysimmediatelyafterPCR●Thermalconditions(afterlastcycleofPCR):–Holdat95°Cfor20sec–Holdat60°Cfor20sec–Rampandcollectfluorescentdatato95°Coverco

23、urseof20minutes●Softwareautomaticallygeneratesmeltcurveprofiles14融解曲线(Dissociationcurve)原始图谱导数图谱15高分辨溶解曲线（HRM,HighResolutionMelting）●DifferentfromaregularSYBR®Greendyemeltcurve:–Chemistry:SaturatingandbrighterdsDNAbindingdyes•LCGreen®EvaGreenTMSYTO®9–Instrument:Moreda

24、tapointsarecollected–Software:Newfluorescentnormalizationalgorithmsandplots16NowcanbeperformedontheABI7500FastSystem●Theanal