孔雀石绿ELISA

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1、隐形孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定汇报人：导师：汇报时间：摘自《食品科学》01OPTIONS02OPTIONS03OPTIONS04OPTIONS实验背景及意义实验方法及过程实验结果及分析个人收获目录结构孔雀石绿简介孔雀石绿(malachitegreen，MG)别名中国绿、品绿，属于有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，也常用作处理受寄生虫影响的淡水水产。由于孔雀石绿具有高毒素、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用，当其进入生物体内，就会快速代谢产生具有更强危害的隐性孔雀石绿(leucomalachitegreen，LMG)。200

2、2年5月中国农业部将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。2005年《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》国家标准要求孔雀石绿在水产品中的检出率不得超过1g/1000t。多克隆抗体简介抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Moncloneantibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五

3、类抗体。ELISA技术简介酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay）ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。本次试验采用的是间接酶联免疫吸附法，示意图如下：实验方法Step1化学合成法合成隐形孔雀石绿衍生物Step2隐形孔雀石绿衍生物与BSA偶联制备免疫抗原Step3抗原免疫新西兰白兔，获取抗隐形孔雀石绿多克隆抗体Step4特异性抗体效价的测定实验方法实验步骤一隐性孔雀石绿衍生物的合成隐性孔雀石绿的分子结构不具有和蛋白偶联的活性基团，所以合成带有羧基的隐性孔雀石绿衍生物是与载体蛋白偶联的基础。半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗

4、体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子（载体）结合，纯蛋白会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。4-甲酰基苯甲酸1.2gN,N-二甲基苯胺3.2mL无水乙醇中回流24h(氮气保护)氯化锌3.2g将混合物溶于40mL甲醇中，用HCl调pH值至5.0过滤收集淡绿色结晶，用去离子水清洗，真空干燥，重结晶实验方法实验步骤二隐性孔雀石绿-BSA全抗原的制备将前期实验合成的隐性孔雀石绿衍生物用碳化二亚胺法合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA。具体步骤如下：称取8mgCLMG溶于0.1mol/L的含50%二甲基亚

5、砜的MES缓冲液(pH6.0)中，加入4.4mg碳化二亚胺和2.6mgN-羟基琥珀酰亚胺。混合物室温搅拌30min，逐滴加入50mL1mg/mLBSA溶液中。混合物室温搅拌2h，用0.1mol/LPBS(pH7.4)透析，去掉未反应物，即制备出隐性孔雀石绿-BSA全抗原。BSA：牛血清蛋白碳二亚胺：主要用于活化羧基，使羟基和氨基间脱水形成酰胺键。PBS：磷酸盐缓冲液，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。N-羟基琥珀酰亚胺：用于在酰胺键形成时活化羰基基团，减少副产物。实验方法实验步骤三抗隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备应用免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA，采用常

6、规免疫程序免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。空白组背部皮下注射甲试剂1ml/只两周后，背部皮下注射乙试剂1ml/只两周后，同上1周后采血制备抗血清，用免疫沉淀实验检测抗体效价。并加强免疫，每次用量均为1mL0.4mg/mL的全抗原，且不加任何佐剂，隔周注射，直到抗体效价不再升高为止。甲试剂：将制备的完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，使抗原终质量浓度为0.4mg/mL。乙试剂：换做弗氏不完全佐剂乳化，其他处理同甲。获取抗体时，采用颈动脉插管取血，血样先27℃放置1h，然后置于37℃2h，最后4℃过夜。肉眼观察血块收缩后，轻轻吸取血清。血清用硫酸铵沉淀法进行纯化。将2mL预处理的血

7、清与等体积pH7.40.02mol/LPBS溶液混匀，于冰上拌并缓慢逐滴加入4mL饱和硫酸铵(预冷)。置4℃条件下3h，使其充分沉淀(或于4℃冰箱中静置过夜)。6000r/min离心10min，弃上清液。用PBS溶解该沉淀至5mL，逐滴加饱和硫酸铵2.5mL(体积比0.5:1)，置0℃条件下3h。6000r/min离心10min，弃上清液。用PBS溶解该沉淀至5mL。逐滴加饱和硫酸铵2.5mL(体积比0.5:1)，置0℃条件下3h。6000r/min离心1