海洋微生物来源的天然活性物质的筛选策略1

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1、海洋微生物来源的天然活性物质的筛选策略NewTechnologiesforDiscoveryofNaturalRroductsfromMarineMcrooganisms摘要：细菌耐药性产生和新药退化的速度越来越快，使得寻找新型抗菌药物迫在眉睫。目前上市的新药数量很少且基本都是对已上市药物的结构进行改造，很难从本质上改变细菌的耐药性问题。自然界中微生物（尤其是海洋微生物）的多样性及其代谢产物的多样性，为发现新药以及先导化合物提供了不竭动力。海洋微生物在所处环境和代谢途径上与陆地微生物有很大不同，人类在陆地资源开发陷入瓶颈之际，应更多地关注新生境、新资源给天然药物开发带来的活力

2、。面对日益严重的病原微生物耐药性，以及天然药物筛选过程中大量的重复发现，如何采用新技术、新资源、新模型筛选发现新的活性次生代谢产物，已成为天然药物开发中亟待研究的重要课题。关键词：细菌耐药性；海洋微生物；先导化合物；药物筛选；次生代谢产物20世纪，虽然新型抗生素的发现和临床开发已经在医学上迈进了一大步，但抗生素耐药性问题也日趋严重，耐药性产生的速度远远快于新型抗生素的发现的速度。1962年以来，只有三类新型抗生素应用于临床：2000年上市的利奈唑胺（linezolid，噁唑烷酮类抗菌药，辉瑞制药），2003年上市的达托霉素（daptomycin，环酯肽类抗生素，Cubist制

3、药公司）以及最新上市的瑞他帕林（retapamulin，截短侧耳素衍生物，葛兰素史克制药公司）。随着耐药菌株和新型病原菌的出现，迫切需要发现具有新型抗菌机制的药物。自然界中含有丰富的微生物资源，有学者认为，其中99%以上的微生物是不可培养的。微生物（尤其是海洋微生物）的多样性及其代谢产物的多样性，为发现新药以及先导化合物提供了不竭动力。面对日益严重的病原微生物耐药性，以及天然药物筛选过程中大量的重复发现，如何采用新技术、新资源、新模型筛选发现新的活性次生代谢产物，已成为天然药物开发中亟待研究的重要课题。前人给我们提供了大量可信的工作和易于理解的综述。本文主要对从可培养的微生物

4、与不可培养的微生物中发现1新化合物的研究方法方面进行综述。1从可培养的微生物中发现新的化合物1.1Genome-mining为导向的微生物来源的天然产物的发现近年来，基于结构相似的次生代谢产物的合成基因簇也有一定程度相似性的假设，基因筛选成为寻找新化合物的重要手段之一。通过将特定基因作为筛选标记，可以在基因水平上评估相应菌株的活性物质产生能力,从而筛选到在初始条件下菌株低表达或不表达的活性物质；另一方面，通过对基因筛选所获得的次生代谢产物合成相关基因(簇)进行生物信息学分析，可以初步预测产物结构，在一定程度上避免化合物的重复发现。放线菌的大部分次生代谢产物是通过聚酮合酶(po

5、lyketidesynthase，PKS)和非核糖体多肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS)途径形成主要结构模块；而活性产物更重要的一个特性—结构多样性，则是由一类称为后修饰酶的蛋白决定的，其中包括卤化酶。卤化作为赋予次生代谢产物生物活性的一种重要修饰行为，常常通过依赖黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)的卤化酶引入。基于上述假说，这种同源基因可以被用作合适的标记在分子水平上预测产物结构。目前已有将此策略成功应用于筛选天然含卤化合物产生菌的报道。1.1.2FADH2-依赖型卤化酶序列特异性通过对FADH2-依赖型卤化酶氨基酸序列（约55

6、0AA）比对发现，在氨基酸末端有两个保守区域[1]（图1），其中一个为靠近氨基端的保守序列GxGxxG，该序列与黄素的结合相关；另一个为位于蛋白中间包含两个色氨酸残基的保守序列WxWxIP，两个色氨酸残基与黄素相邻，可能是起到阻止底物与黄素结合的作用[2]。图1.FADH2-依赖型卤化酶氨基酸序列保守区域1.1.2FADH2-依赖型卤化酶在寻找天然卤化物方面的应用很多卤化物的生物合成基因簇中的卤化酶为FADH[3]2-依赖型卤化酶。Hornung等利用avilamycin、simocyclinon、complestatin、balhimycin、calicheamicin和a

7、nsamitocin的卤化酶保守区域设计一对简并引物，对550株随机选择的放线菌进行筛选，发现其中103株（约20%）含有潜在的FADH2依赖型卤化酶基因。并通过与已知的卤化酶进行比对，根据具有相似结构的次级代谢产物的生物合成基因簇中往往含有某些同源性很高的基因这一假说，Hornung等通2过对一株含有与糖肽类balhimycin卤化酶相似性为93%的放线菌进行研究，发现了一个糖肽类抗生素cb2364（图2a）新的产生菌。另外，将其中一株放线菌假定的卤化酶基因及其连锁的PKSII型基因簇在背景较清楚的白