微滴度PCR(ddPCR)的原理和最新应用

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1、第三代PCR技术——ddPCR的原理和医学应用ddPCRdropletdigitalPCR微滴式数字PCR陈燕飞，Ph.D.FieldApplicationSpecialist,Bio-RadLaboratories主要内容ddPCR的基本原理ddPCR的技术特征ddPCR的医学介绍（ddPCR，dropletdigitalPCR，微滴式数字PCR）主要内容ddPCR的基本原理（什么是数字PCR？什么是微滴式数字PCR/ddPCR?）PCR技术的发展历程（1983-2015年）第一代第二代第三代更灵敏更准确更精确T100Th

2、ermalCyclerCFX96/384Real-timePCRQX200DropletDigitalPCR普通PCRReal-timePCR数字PCR定性分析间接定量分析直接定量分析（依赖C或C值，标准品）（无需标准品，绝对定量）tq第三代PCR技术——数字PCR（digitalPCR,dPCR）基本原理：0或1的反应（以ddPCR为例）泊松分布●::阳性微滴（靶标分子1）○::阴性微滴（背景分子0）有限稀释PCR扩增泊松分布一个成千上万个阴性微滴比例推算待分析的PCR反应体系独立的PCR反应体系起始靶分子的绝对量数字PCR的

3、核心思想1992年数字PCR思想的提出AlecMorley利用有限稀释，终点PCR和泊松分布实现核酸浓度的绝对定量Thecombinationoflimitingdilution,end-pointPCR,andPoissonstatisticscouldyieldanabsolutemeasureofnucleicacidconcentration.今天数字PCR的应用发展就像1990年代末real-timePCR的发展（NatureMethod，2014）PCR技术发展的一种趋势数据来源：GoPubMed，2016年6月11日

4、更新(JoVandesompele)基于微滴的数字PCR——微滴式数字PCR（ddPCR）QX200ddPCR（QX100ddPCR的升级版，同时兼容染料法和水解探针法检测）QX200AutoDGddPCR（目前市场上唯一的数字PCR自动化产品）ddPCR的工作流程：QX200ddPCR手动操作步骤自动操作步骤视频：QX200ddPCR的工作流程ddPCR的工作流程：QX200AutoDGddPCR手动操作步骤手动操作步骤自动操作步骤自动操作步骤视频：QX200AutoDGddPCR的工作流程ddPCR的技术特征（ddPCR与re

5、al-timePCR等现有技术有什么不同和进步？）ddPCRvsReal-timePCR，castPCR，array，NGS，FISH，CE……ddPCR技术特征（一）：微滴化可实现稀有序列的富集ddPCR可以实现痕量核酸的高灵敏检测总反应体积–20μL微滴化分割样品–20,000×1nL40,000个背景核酸（野生型）40个靶基因（突变型）19,960个微滴含2个背景核酸40个微滴含2个背景核酸+1个靶基因靶基因（突变）丰度0.1%靶基因丰度33%ddPCR技术特征（一）：微滴化可实现稀有序列的富集0%mutant(wildty

6、peonly)0.001%mutant0.005%mutantProbespecificassayschemeMUTFRWT0.01%mutant0.1%mutant1%mutant高含量野生型DNA背景下BRAFV600E稀有突变的ddPCR检测（AnalChem83,8604）（DNA定量分析/肿瘤突变分析/基因分型）ddPCR的技术特征（二）：优秀的准确度、精密度和重复性（by中国计量科学院）（DNA定量分析、绝对定量）PrecisionIndependentlyVerifiedandObserved,+/-1.5%Unce

7、rtaintyOverTheoreticalValueGravimetricExperimentsConductedatNationalMeasurementInstitute,NSW(Australia)（by澳大利亚国家计量院）（DNA定量分析、绝对定量）ddPCR的技术特征（二）：优秀的准确度、精密度和重复性（肿瘤相关microRNA定量分析、方法学对比）ddPCR的技术特征（三）：对PCR抑制剂的容忍度更高背景：验证抑制剂对ddPCR反应结果的影响方法：采用经验证的CMVqPCR体系对UL123和UL55进行扩增，并加入S

8、DS、EDTA和肝素作为抑制剂（DNA定量分析/病毒检测/临床复杂样本的检测）ddPCR的技术优势——成功应用的起点能够检测含量极低的核酸序列灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%，原因在于微滴化步骤可以实现靶标DNA/RNA的富集无需